凤丹体胚发生及愈伤组织诱导芽分化研究

【摘要】： 本文研究了牡丹不同时期的种胚直接诱导体细胞胚,并在此基础上实现了体细胞胚植株再生。利用牡丹的叶片、茎段、花药、花瓣进行了愈伤组织诱导,获得愈伤组织的基础上进行增殖和分化培养获得了小植株,并实现了驯化移栽。同时利用石蜡切片和扫描电镜的方法对愈伤组织发育过程中的结构变化进行了观察。主要研究结果如下： 在牡丹体细胞胚诱导方面,本试验结果表明利用‘凤丹’花后110d的种胚诱导率最高。种胚、子叶、胚轴3种外植体进行体细胞胚的诱导,种胚的诱导率最高,为32.5%。利用90g/L的蔗糖溶液处理种胚2h,体细胞胚诱导率为38.0%。对花后110d的种胚进行体细胞胚诱导,‘凤丹’体细胞胚增殖最适合的培养基组合为：MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖60.0 g/L+CH0.4 g/L,体细胞胚诱导率为38.33%。 体细胞胚成熟过程中,活性炭对牡丹体细胞胚成熟具有显著的促进作用,而不同的培养基对体细胞胚成熟效果差异不显著。6-BA能够促进体细胞胚的萌发,GA3对打破休眠促进萌发具有较好的效果。IAA对促进体细胞胚生根效果较好。本文首次探讨‘凤丹’体细胞胚直接诱导,首次深入研究了添加物质CH和活性炭对体细胞胚诱导及成熟的影响,首次对‘凤丹’进行体细胞胚诱导,诱导率均在15%以上,最高诱导率达到38.33%,并成功获得了体细胞胚植株。 牡丹叶片愈伤组织诱导过程中,改良MS培养基为诱导牡丹叶片愈伤组织的最佳培养基,在未添加任何植物植物激素的培养基上无法诱导出愈伤组织,单独添加生长素或细胞分裂素均能诱导出愈伤组织,但诱导率有差异,最佳的生长素是2,4-D 0.2 mg/L,最佳的细胞分裂素是TDZ 2.0 mg/L。用2,4-D、NAA、TDZ正交试验得到最佳组合为改良MS+2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 3.0 mg/L,愈伤诱导率高达87.8%。利用牡丹幼嫩茎段为外植体,进行愈伤组织诱导,通过试验得出最佳的培养基组合为MS+NAA0.05mg/L+6-BA2.0 mg/L+2,4-D1.0 mg/L为最佳的培养基组合,在此培养基诱导下,茎段愈伤组织诱导率达到最高的87.8%。牡丹茎段愈伤组织诱导率在不同蔗糖浓度时的大小顺序为30.0 g/L40.0 g/L20.0 g/L10.0 g/L,因此最佳的蔗糖浓度为30.0 g/L。利用茎段的中下部、将外植体横放在培养基上会获得较高的愈伤组织诱导率和较多的愈伤组织。试验证明,牡丹花药诱导愈伤组织的最佳时期为花粉的单核中期,最佳的培养基为MS+2,4-D2.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA1.0 mg/L,在最佳培养基、蔗糖质量浓度为6%,4℃的低温条件下处理8d的愈伤组织诱导率最高达到50.8%。利用花瓣诱导愈伤组织,最佳的培养基组合为MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L,诱导率达到98.9%。 牡丹愈伤组织增殖过程中,叶片愈伤组织最合适的增殖培养基为MS+NAA0.2mg/L+6-BA2.0+KT2.0 mg/L,增殖率为209.8%。不同碳源对愈伤组织增殖的影响不同,30.0g/L的蔗糖为合适碳源。添加浓度为0.4g/L的CH效果最好。试验结果表明叶片愈伤组织增殖的生长曲线为S型曲线,生长分为延缓生长期、指数生长期和静止期三个时期,生长周期为30d左右。茎段和花瓣的增殖培养基相同,均为MS+NAA0.2mg/L+6-BA3.0mg/L+蔗糖30.0g/L+CH0.4g/L+琼脂7.0g/L,增殖率分别为237.3%和233.5%。而花药的增殖培养基为MS+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+蔗糖30.0g/L+CH0.4g/L+琼脂7.0g/L,增殖率为230.9%。光照12h对牡丹茎段愈伤组织的增殖效果最好。 研究了光照强度、抗氧化剂和吸附剂对愈伤组织褐化率的影响,认为在转接初期将所有愈伤组织,放置在黑暗条件下培养1周左右后转移到光照强度为19umol/m2/s下培养,既能够保证愈伤组织的增殖生长,又降低愈伤组织在增殖过程中的褐化。几种抗氧化剂能够大大降低愈伤组织褐化率。其中AgNO3对愈伤组织褐化的抑制效果最好。对于各种吸附剂而言,1.0g/LPVP和2.0g/L活性炭两种吸附剂抑制褐化效果最好。 牡丹愈伤组织结构细胞学观察。牡丹的芽原基不是从愈伤组织表面发生,而是发生于愈伤组织的近表层,然后突破表层细胞开始发育。通过石蜡切片发现在不同的发育阶段不同形状的胚状体同时存在,不同的愈伤组织细胞结构差异较大。 通过扫描电镜可以看出,不同的愈伤组织培养的不同时间会发生不同的变化,有的愈伤组织可以发育成胚状体,有的则无法完成正常的发育,同一块愈伤组织可能存在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织两种不同的类型。从牡丹愈伤组织的发育过程中来看,继代后15-20d是愈伤组织发育最快的时期,经过这一时期后愈伤组织发育开始减慢。 在牡丹愈伤组织分化过程中,最合适的叶片愈伤组织分化培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+TDZ0.3 mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L,分化率为22.22%。茎段愈伤组织最适合的分化培养基为MS+6-BA3.0 mg/L+NAA0.2mg/L,分化率为24.44%。花药愈伤组织分化的最佳培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+KT0.3mg/L,分化率为22.22%,干燥处理3d有利于花药愈伤组织的分化。花瓣愈伤组织分化的合适培养基为MS+ZT 0.5 mg/L+6-BA2.0 mg/L,分化率为34.81%。 对于愈伤组织诱导形成的植株,在各种不同培养基上诱导生根,1/2MS和WPM两种培养基是合适的培养基,最适合的蔗糖浓度为30.0g/L。最佳的培养基组合为1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30.0g/L。小植株在驯化后能够移栽成活,成活率为40.0%左右。