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《中国原子能科学研究院》 2002年
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吖啶酯DMAE·NHS的合成及TSH和TT_4化学发光免疫分析的研究

尹东光  
【摘要】: 在各种非放免疫分析方法中,化学发光免疫分析(CLIA)具有灵敏度高、检测范围宽、精密度好、标记物稳定、可实现全自动化、应用范围广等优点,CLIA是一种先进的免疫分析方法。以吖啶酯衍生物为发光标记物的CLIA的特点是:标记简单、标记物稳定、不需要催化剂、自然本底低、受外界干扰因素少、信噪比高、发光体系简单等。 目前国内尚未见有关DMAE·NHS的合成及其应用于CLIA的研究报导,本论文研究了吖啶酯DMAE·NHS的有机合成方法,DMAE·NHS的发光性能,DMAE·NHS及其与抗体偶联物的热稳定性,DMAE·NHS标记TSH单克隆抗体和链亲和素,TSH CLIA,TSH BAS-CLIA和TT_4 BAS-CLIA。 DMAE·NHS的合成是本论文的关键和难点,我们对文献方法进行改进:文献方法用氢氧化钠与3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸反应制得3,5-甲基-4-羟基苯甲酸钠,再用3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸钠与苄氯作用制备3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸苄酯,我们用氢氧化钾代替氢氧化钠,使合成取得成功;在合成2',6'-二甲基-4'-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基-吖啶-9-甲酸酯时,文献方法对粗产品进行两次硅胶柱层析纯化,第一次柱层析用氯仿/乙酸乙酯(4:1,Ⅴ:Ⅴ)作溶剂和淋洗剂,第二次柱层析用己烷/丙酮(2:1,Ⅴ:Ⅴ)作溶剂和淋洗剂,按照文献方法得到的不是所需要的化合物,我们只进行第一次柱层析纯化,然后用己烷/丙酮(2:1,Ⅴ:Ⅴ)进行研磨,过滤,洗涤,除去溶于己烷/丙酮(2:1,Ⅴ:Ⅴ)的部分,得到所需要的产品。合成产物经IR、~1HNMR、MS和元素分析表征为所期望的化合物。 对DMAE·NHS发光性能的研究表明,DMAE·NHS的发光为闪光,0.4s时发光强度达到最大,发光半衰期约为0.9s,发光强度为6.11×10~(18)cps/mol。发光启动试剂的组成对其发光强度有影响,表面活性剂如CTAC,TritonX-100,Tween-20等能增强其发光。DMAE·NHS与抗体偶联物DMAE·NHS-Ab的发光性能与DMAE·NHS相似,DMAE·NHS与Ab的分子比为2.4时其发光强度为1.8×10~(19)cps/molAb。DMAE·NHS及DMAE·NHS-Ab具有良好的热稳定性,4℃或冰冻下,在pH7.0的PB缓冲液中,半年后它们的发光活性或免疫活性基本没有 中国原子能科学研究院博士学位论文 下降,室温或37’C下,由于水解而降低发光活性,它们的热稳定性随温度升高_ 而降低,随熔液pH值增大DMAE佣S的热稳定性降低,而DMAE棚S-Ah在 中性溶液中最稳定。 以 DMAE·NHS为发光标记物,研究建立了两种 TSH CLIA方法,均采用一 步夹心免疫分析法,在第一种方法中一株抗TSH单克隆抗体包被微孔板,另一 株标记DMAE·N’HS,方法的分析灵敏度为0.olmIUA,批内变异系数为 4.29巧.71%,批间变异系数为 4.36ed.14%,平均回收率为 98%,与 TSH IRMA法 的相关方程为 Y-0.20+0.92X,相关系数为 0.993,与 Ciba Co讪ng TSH CLIA测 量值的相关方程为 Y—0.16+0.92兄相关系数为 0.986。在第二种方法中,引入 生物素-链亲和素放大系统①AS),该方法用到的两株TSH单抗,一株包被微孔 板,另一株标记生物素,DMAE·NHS标记链亲和素,该方法亦具有良好的精密 性和准确性,与 TSH IRMA及 Ciba Co而flg TSH CLIA测量值呈明显相关,其分 析灵敏度较第一种方法高,为0刀07mIU/l,这两种方法之间亦相关良好。论文最 .后对TT CLIA方法进行了研究,并初步建立起T乙 BAS-CLIA方法,该方法 _用T4单抗包被微孔板,T4ESA标记生物素,DMAE·NHS标记链亲和素,采用 8 。一步法竞争免疫分析。 ,研究结果表明:DMAE·NHS具有良好的发光性能,易与抗体偶联,偶联物 稳定,发光体系简单,是一种理想的化学发光免疫分析标记物,以DMAE·NHS 做发光标记物建立的 TSH CLIA、TSH BAS-CLIA和 TT4 BAS-CLIA方法,标准 曲线线性好、信噪比高、检测范围宽、具有较高的灵敏度,良好的精密度、准确 性和健全性,与 IRMA方法及 Ciba Coming CLIA的临床测量值相关性良好。
【学位授予单位】:中国原子能科学研究院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:O657.3

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