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《中国原子能科学研究院》 2004年
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放射性Annexin V的细胞凋亡显像剂研究

陈大明  
【摘要】:细胞凋亡是生物体一种调节细胞群体相对恒定的重要方式,近年已成为生命科学中一个非常热门的研究热点。细胞凋亡早期的特征是磷脂酰丝氨酸基团(PS)的外翻,能与PS高度特异性结合的Annexin V成为了研究早期细胞凋亡的重要标识物。近年在分子核医学显像研究中,用放射性核素标记Annexin V的凋亡显像剂研究也取得了很大的进步,这对提高对疾病的认识、评价指导疾病的治疗以及新药的开发等都具有重要的意义。 本论文研究的主要目的是在已有的文献基础上,利用国内基因工程技术制备的重组的人Annexin V进行放射性核素的标记和评价,希望制备出可用于临床细胞凋亡研究的显像剂。本论文的主要研究内容如下: 1、重组Annexin V的制备纯化 研究了工程菌的诱导表达和蛋白质的纯化。建立了Annexin V工程菌诱导表达的最佳温度、时间和包涵体的操作程序,并通过离子层析纯化后得到了高纯度的Annexin V。 2、~(131/125)I-Annexin V的制备研究研究了~(131/125)I-Annexin V的标记条件和稳定性,建立了纸色层和高压液相的分析方法。采用Iodo-Gen标记法,反应10min后,~(131/125)I-Annexin V的标记率大于80%,经PD-10纯化后,其放化纯大于95%。标记物在室温下稳定性较好。ITLC-SG薄层分析,展开体系为正丁醇/乙醇/氨水(5/1/2),Rf:标记物=0.0-0.1,Γ=0.5-0.7,碘酸=0.7-0.9。HPLC:GF250色层柱,流动相为0.01mmol/LPBS,流速为1.0ml/min,保留时间:标记物为6.3min,游离碘为9.7min。3、~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V的制备研究研究了双功能偶联剂的S-HYNIC的合成、偶联剂与Annexin V的连接和~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V的标记以及纯化,建立了薄层分析和高压液相的分析方法。(1)合成的S-HYNIC经元素分析、IR、~1H-NMR、快原子质谱确证为所预期的化合物。解决了合成中关键的第三和第四步中3个难点:除去DMF、无水和去BOC问题。(2)偶联条件:1mol Annexin V(5.5mg/mL)与6mol S-HYNIC在HEPES溶液中避光反应5h,每个Annexin V连接上2个HYNIC,比文献值 中国原子能科学研究院博士学位论文 高一倍。首次研究了缓冲溶液对偶联的影响。(3)通过“3+1”的二元混合配 体络合的方案,以Tricine作为协同试剂,氯化亚锡作为还原剂,室温反应30min 后,制备得放化纯95%的”9’”几一H翎xe一Annexinv。标记物t匕活度为26.sMBq 恤gAnnexinV,比文献值要高2倍以上。 4、生物学评价和动物实验 研究了”’‘’2’I一Annexinv、”9nl介一H州le一Annexinv的体内外生物学性质和动 物实验。(l)”51一Annexinv能在体外检测细胞的凋亡,与FITc一Annexinv流 式细胞分析的结果能较好的吻合。首次初步建立了’2,I一Annexinv体外细胞凋 亡的放射配基结合分析的基础。(2)通过细胞结合分析定量测定了Annexinv 的生物活性,Ko=8.53士3.3OnmolzL,盯一8.79士2.2Inmol/L。(3)正常小鼠体内分 布表明:’2行一Annexinv主要浓聚于肝、脾、肾,在体内易脱碘:”gmTc- HYNIC一AnnexinV主要浓聚于肝、脾、肾和肺,从肾脏排泄。(4)通过sn大 鼠凋亡模型的分布和显像实验:确定了环磷酞胺诱导骨髓内细胞的凋亡(主 要在脾脏和股骨等脏器)的最佳时间为72h:首次确定了’3’I一Annexinv的最 佳凋亡显像时间为6h,”glllTc一HYNIc一Annexinv为3h。(5)环磷酞胺诱导凋亡 的动态显像结果表明,注射”gmTc一HYNIc一Annexinv后,实验组与对照组的 股骨的放射性浓聚比值随时间的增加而增加,在lh后增加的速率放慢,3h达 到最大。验证了3h为”gmTc一HYNIc一Allnexinv的最佳凋亡显像时间。 总之,本论文是首次利用国内制备的重组人AnnexinV进行放射性核素的 标记和评价,其中用’2,I一Annexinv进行体外细胞凋亡的放射配基结合分析,以 及确定”’l一Annexinv和”gm几一H洲Ie一Annexinv的最佳凋亡显像时间的实验, 还未见有文献报道。现有的实验结果表明:’2,I一Armexinv能在体外检测细胞的 凋亡;制备的’3’‘’2,I一Annexinv和”9,,,几一H州Ie一Annexinv可以有效检测鼠类体 内的细胞凋亡,特别是”gmTc一HYNIc一Annexinv将会成为临床上一种很有前景的 体内细胞凋亡显像剂。
【学位授予单位】:中国原子能科学研究院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R817

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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5 李旭阳;电针“足三里”、“三阴交”穴对脾气虚证大鼠血清NO、ET-1的影响[D];辽宁中医药大学;2011年
6 胡雄飞;氟虫腈对PC12细胞毒作用及其机制的初步探讨[D];华中科技大学;2009年
7 蔡芬芬;链霉亲和素—荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用[D];华中科技大学;2010年
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10 张汉文;肿瘤受体显像剂——~(99)~TcM-Tricine-HYNIC-Tyr~3-Octreotide 的研制[D];中国原子能科学研究院;2000年
【同被引文献】
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【二级引证文献】
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