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HIV-1 DNA疫苗佐剂及两种病毒载体基因表达谱研究

侯爵  
【摘要】:时至今日,HIV疫苗研究仍面临众多难题。以DNA为载体的HIV疫苗中,如何提高抗原免疫原性,提高特异性免疫应答强度是关键性难点;而以病毒为载体的疫苗,如何根据病毒载体诱导免疫应答反应的特点来选择病毒载体类型,亦是亟需解决的问题。为增强DNA疫苗免疫原性,本研究中选取多种类型佐剂,考察候选佐剂的免疫学特性及潜在的生物学机制,以期寻找适宜的HIV DNA疫苗佐剂。本文中利用体外建立的小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)模型,结合Toll-Like Receptor(TLR)信号通路激活、树突状细胞活化及其分泌细胞因子类型等实验,综合评价了寡聚核苷酸(CpG)、卡介菌多糖核酸注射液(BCG-PSN)、鞭毛素蛋白(Flagellin)、铜绿假单胞菌注射液(PA-MSI IA)及霍乱肠毒素B亚单位(CTB)等五种不同类型佐剂体外免疫激活效果。经体外实验筛选出的PA-MSHA和CTB佐剂,与HIV DNA疫苗联合免疫小鼠,研究佐剂增强DNA疫苗抗原特异性免疫应答反应。结果显示,PA-MSHA和CTB均能够激活TLR信号通路,进而刺激BMDC成熟,促进BMDC分泌多种细胞因子;PA-MSHA应用于HIV DNA疫苗中呈现剂量依赖效应,低剂量PA-MSHA可增强HIV-1 Env DNA疫苗诱导的特异性细胞免疫反应及抗体应答水平,而高剂量则反映出免疫抑制效应。本文亦首次证实CTB作为常用粘膜佐剂,可通过肌肉注射提高HIV-1 DNA疫苗的免疫原性,能够诱导高水平的抗原特异性细胞及体液免疫应答,且抗原特异性免疫反应强度可能与CTB诱导的炎症应答相关。为改善HV Gag DNA疫苗免疫原性弱的困境,首创性的借助]HIV Gag与宿主蛋白亲环素A(CyPA)的特异性相互作用可促进树突状细胞成熟和抗原提呈,进而激活T细胞应答的假说,设计了以HIV-1 Gag为抗原,以CyPA为基因佐剂的DNA疫苗。经多种策略验证了CyPA具有Gag抗原特异性佐剂效果;且CyPA的基因佐剂效应源自与Gag抗原的特异性相互作用,当单点突变CyPA失去与Gag结合能力后则不再具备佐剂效果,而三点突变CyPA由于仍然保持与Gag的相互作用则体现出增强细胞免疫应答特性。CyPA与Gag联合免疫,可提高Gag诱导的特异性细胞免疫应答的广谱性,并Gag/CyPA双表达盒系统可诱导长达半年的高水平Gag特异性细胞免疫应答。本研究中选择了两种HIV疫苗候选病毒载体,利用临床试验系统比较了黄热病毒疫苗与痘病毒疫苗接种后基因表达谱的差异,重点分析了在免疫接种后各个时间点基因本体学及信号通路的特征,并结合时间序列分析和转录因子动态分析策略,研究了两种病毒载体诱导的基因表达谱动态变化过程。结果显示,黄热病毒疫苗在免疫接种后非常早期(4小时)即有众多基因差异性表达,而痘病毒疫苗在免疫后9-14天时才出现基因表达峰值。黄热疫苗接种后可迅速激活免疫系统,在接种后5-7天天然免疫和获得性免疫应答广泛激活,细胞因子表达升高尤其是Ⅰ型干扰素介导的信号通路激活,在28天时仍有细胞因子受体及炎症因子的表达上调;而痘病毒疫苗接种后前3天基本无基因表达改变,在第9-14天表达峰值时差异基因主要集中在淋巴细胞分化、T细胞活化、NF-κB信号通路调节、淋巴细胞归巢及天然免疫应答中应激性防御反应和树突状细胞趋化等,第28天时仍有持续性转录因子活化表达,TLR信号通路激活和T、B细胞活化调节。时间序列分析显示,黄热疫苗诱导的免疫应答相关基因及信号通路的变化模式较为复杂,而痘病毒疫苗诱导免疫相关基因的变化相对简单。结合转录因子调控预测分析,黄热病毒疫苗接种早期即诱导大量转录因子如STAT1、IRF9、IRF7、 FOS及JUNB等在不同时间点调控基因表达,而痘病毒疫苗诱导转录调控因子无显著性改变。本研究为HIV DNA疫苗免疫原性,优化佐剂筛选策略等提供了新途径,并为选择合适疫苗用病毒载体提供了新思路。


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