GMA致16HBE细胞遗传物质损伤及对修复基因表达影响的研究

【摘要】：甲基丙烯酸环氧丙酯(Glycidyl methacrylate,GMA),别名甲基丙烯酸缩水甘油酯,是丙烯酸酯胶的主要组分,是一种高强度合成粘合剂的单体,该化学物分子既含有碳碳双键,又含有环氧基,具有很高的反应活性,能够使相关产品具有优良的防紫外、耐水和耐热等特性,因此在军事和民用工业中应用广泛。 本研究课题组自80年代中后期首次从我国现场筛选出来并报道GMA致突变性以后,在国家自然科学基金等的连续资助下对其毒性、致突变性和潜在致癌性进行了一系列的研究工作。结果显示,GMA能与DNA共价结合,诱导原核生物基因突变,哺乳动物染色体损伤,人和大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤,抑制DNA半保留复制,在体外GMA可诱导BALB/C 3T3细胞、金仓鼠细胞(SHE)、正常人胚肺成纤维(HELF)细胞等不同类型细胞发生恶性转化,转化作用呈剂量-效应关系,提示GMA具有潜在致癌性。 细胞体外转化试验是研究癌变机制的重要方法,以人的上皮细胞为背景进行肿瘤发生发展的试验研究,在种属和组织差异方面更具优势,是化学物致癌机制研究的发展趋势。16HBE(human bronchial epithelial)细胞是SV40 large T抗原永生化的人支气管上皮细胞株,保留着正常人支气管上皮细胞的特定形态和功能,在体外易于培养,裸鼠体内无致瘤性,可以作为一种较理想的靶细胞用于潜在化学致癌物检测及诱发细胞恶性转化机制的研究。 本研究选用人支气管上皮细胞(16HBE)作为靶细胞,从染色体和DNA水平观察GMA对16HBE细胞遗传物质的损伤作用,即检测GMA致16HBE细胞染色体的损伤,以及转化细胞DNA修复基因点突变的情况;同时采用“基因组稳定和DNA修复基因芯片”检测GMA致16HBE细胞恶性转化相关DNA修复基因表达改变的情况,以探讨GMA的潜在致癌性。 研究获得的主要结果如下: 1.GMA致16HBE细胞遗传物质损伤的研究 1.1 GMA对16HBE细胞染色体的损伤作用 不同剂量GMA染毒16HBE细胞24hr,诱导16HBE细胞染色体发生畸变,呈剂量-效应关系。16μg/ml和20μg/ml剂量组与溶剂对照组相比,细胞染色体畸变率显著增高(P＜0.05)。GMA诱导16HBE细胞产生的染色体结构畸变类型主要有断裂、碎片、双着丝点、环状染色体、三射体等。未观察到染色体数目畸变。 低剂量(8μg/ml)GMA多次染毒16HBE细胞染色体畸变分析表明,16HBE细胞连续3次GMA染毒,与溶剂对照比较细胞染色体畸变率显著增高(P＜0.05),且随着染毒时间延长,细胞染色体畸变率升高。细胞染色体畸变以结构畸变为主,未观察到染色体数目畸变。 对GMA诱导的16HBE转化细胞进行染色体畸变分析,转化细胞与对照细胞染色体结构畸变发生率无统计学差异(P＞0.05);染色体核型分析显示,转化的16HBE细胞失去正常核型,二倍体细胞减至79%,亚二倍体和超二倍体细胞增多,与溶剂对照相比,核型改变存在显著性差异(P＜0.05)。 1.2 GMA致16HBE转化细胞DNA修复基因点突变的分析 采用PCR-RFLP方法对GMA致16HBE转化细胞的DNA修复基因hMSH2基因C471A、G322A、IVS12-6(T＞C)及IVS1+9(C＞G)位点,XRCC1基因C26304T、G27466A、G36189A位点,XPD基因G23591A、A35931C位点及XRCC3基因C18067T位点的点突变情况进行分析,并应用DNA测序法(双脱氧末端终止法)对分析结果进行验证。结果显示,与对照细胞相比,转化细胞中hMSH2基因IVS12-6(T＞C)位点突变为TC基因型,未检测到其它位点的突变。 2.GMA致16HBE细胞恶性转化相关DNA修复基因表达的改变 采用“基因组稳定和DNA修复基因芯片”检测GMA转化细胞和对照细胞中DNA修复基因表达情况,分析两者的差异。应用GEArray Analyzer软件分析显示,GMA转化细胞与对照细胞比较,在113个基因中有8个基因的表达有显著差异,其中7个基因表达上调(ratio＞2),分别是NBS1、RAD50、RAD51、OGG1、XAB2、TOP3a、TNKS;NEIL2基因表达下调(0＜ratio＜0.5)。 NBS1、RAD50、RAD51基因是双链断裂修复通路(DSBR)中的重要的功能基因,OGG1及NEIL2基因是碱基切除修复通路(BER)中的重要基因,XAB2是参与核苷酸切除修复(NER)的基因,TOP3a和TNKS是与基因组稳定相关的基因。上述DNA修复基因表达的改变进一步提示GMA致16HBE细胞恶性转化是一个多基因参与的复杂过程,涉及多个基因多条修复通路的协同作用。 综上所述,本研究探讨了GMA致16HBE细胞恶性转化过程中对遗传物质的损伤,及其对DNA修复基因表达改变的影响。结果提示GMA可通过对染色体的损伤影响其所携带基因的结构和功能改变,且GMA通过改变DNA修复基因结构及对相关DNA修复基因表达的影响,从而导致细胞修复功能缺陷及损伤—修复的平衡紊乱,基因组稳定性下降,最终导致正常细胞恶性转化。本研究工作为深入探讨GMA的潜在致癌机制提供新的线索,同时也为GMA致癌危险度评定、开展流行病学监测奠定了理论基础。