安徽株H5N1 NP的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

【摘要】： 人禽流行性感冒(简称人禽流感)是由某些亚型的禽甲型流感病毒株引起的急性呼吸道传染病。自1997年禽流感病毒H5N1感染人类至今,高致病性禽流感在亚洲多个国家和地区爆发流行,给当地的国民经济和人民健康造成极大危害,因此研究禽流感病毒对人的致病机制是我们有效预防和控制人禽流行性感冒要解决的问题之一。研究病毒结构蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用是病毒学基础理论研究的一个重要方面,针对蛋白相互作用的研究不仅有助于搞清病毒复制和装配的详细机制,而且有利于了解疾病的发病机理。因此利用病毒结构蛋白与宿主(主要是人)细胞蛋白的相互作用来尝试揭示H5N1的发病机制是一种非常好的方法和思路。 本研究联合应用pull-down和LC.MS/MS技术初步筛查与H5N1 NP蛋白存在潜在相互作用的细胞蛋白,并应用免疫共沉淀技术验证SFPQ蛋白与NP的关系。实验内容分为以下三个部分: 第一部分H5N1安徽株核蛋白的表达纯化及BEAS-2B细胞总蛋白的制备 我们构建携带NP基因的原核表达质粒pET-30a-NP;在大肠杆菌中大量表达NP蛋白。应用溶菌酶法和反复冻融方法,获得pET30a-NP诱导表达裂解上清和pET30a-NP诱导表达裂解沉淀,经过SDS-PAGE及western-blot鉴定,结果表明在裂解上清中部分NP蛋白以可溶形式存在,且分子量与NP蛋白理论值一致。应用金属螯合亲和层析和离子交换层析结合的方法对表达获得的NP蛋白进行纯化,经过SDS-PAGE扫描软件分析,SDS-PAGE中只有NP蛋白的单一条带;应用纯化获得的NP蛋白免疫新西兰大白兔,制备H5N1 NP的兔多克隆抗体血清,并应用间接ELISA方法证明该多抗血清的效价大于40000,接近国家流感中心H5N1全病毒兔多抗血清效价值。 第二部分联合应用pull-down及LC.MS/MS技术初步筛查与NP蛋白相互作用的细胞内蛋白 大量制备人支气管上皮细胞的总蛋白,制备过程中应用蛋白酶抑制剂防止细胞内蛋白降解,并应用核酸酶祛除核酸成分。应用pull-down技术获得与NP相互作用的细胞内蛋白样品,样品经过SDS-PAGE分析后,获得四条细胞蛋白条带,利用LC.MS/MS技术鉴定细胞蛋白身份。质谱鉴定及数据库检索结果表明我们获得与NP存在潜在相互作用的细胞蛋白共20个,其中与NP存在相互作用的已知蛋白一个,剪切因子家族蛋白4个,actin结合蛋白2个,RNA结合蛋白3个。 第三部分应用免疫共沉淀方法进一步验证SFPQ蛋白与NP蛋白的关系 我们成功的构建携带NP基因的pEGFP-NP真核表达质粒,经过双酶切鉴定和测序鉴定后,选取阳性克隆质粒转染人支气管上皮细胞,应用western-blot方法和荧光显微镜下观察证明NP蛋白在人支气管上皮细胞内的有效表达;应用免疫共沉淀技术进一步验证SFPQ蛋白与NP蛋白在人支气管细胞内的关系。 本研究初步筛查到与NP蛋白存在潜在相互作用的细胞内蛋白共20个,并对其中的SFPQ与NP蛋白的相互作用做了进一步验证,研究结果为后期H5N1禽流感病毒致病机理研究提供实验依据。

【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.99