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《中国疾病预防控制中心》 2009年
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食品中内分泌干扰物筛选方法体系与大豆异黄酮安全性评价研究

张文众  
【摘要】: 第一部分:食品中内分泌干扰物筛选方法体系研究 目的:建立食品中内分泌干扰物筛选方法体系,探索筛选模型的敏感终点。作为筛选食品新资源、食品添加剂、食品污染物等可能具有内分泌干扰作用物质的方法,为进行食品内分泌干扰物的风险评估提供科学资料和依据。 研究内容:本研究的筛选方法体系包括体外和体内筛选方法部分。体外筛选方法包括:雌激素受体竞争结合试验,从分子水平筛选雌激样活性物质;E-SCREEN试验从细胞水平筛选雌激素样活性物质;卵黄蛋白原(VTG)间接的检测雌素样活性物质;类固醇合成试验从器官水平检测雄激素和或抗雄激素活性物质。体内筛选方法包括:啮齿动物子宫试验用于雌激素和或抗雌激素活性物质的筛选;HERSHBERGER试验用于雄激素和或抗雄激素活性物质的筛选。 方法:体外受体竞争结合试验用荧光偏振法,阳性物采用雌二醇(E_2),E_2浓度分别为2650、530、106、21.2、4.25、0.85、0.17、0.032和0.0064 nmol/l。E-SCREEN试验采用雌激素受体阳性的MCF-7细胞,2.5 mM E_2作为阳性物,用MTT法测定细胞增殖情况。卵黄蛋白原(VTG)测定用酶联免疫反应法,检测转入生长激素的转基因鲤鱼和亲本鲤鱼的VTG水平。类固醇合成试验用睾丸切片法,人类促绒毛膜性腺激素(hCG)作为促进睾酮合成的诱导物,每组均有hCG(+hCG)激发和无hCG(-hCG)两个亚组,阳性物用250mM氨鲁米特(Aminoglutethimide,AMI),阴性对照用10μM非那雄胺(Finasteride,FIN,有英文均统一)),分别与0、1、2、3小时收集培养液,最后测定睾酮(T)的水平。啮齿动物子宫试验用未成年的青春期前大鼠,阳性物用3.0μg/kg E2,和0.1、0.3、0.6和1.0g/kg·bw的白藜芦醇,连续三天灌胃给予受试物;实验结束称量子宫的湿重和干重,对卵巢、子宫和阴道进行组织病理学检查。HERSHBERGER(大小写统一)试验用4-5周未成年SD大鼠,阳性物用3 mg/kgFIN,连续灌胃10天;试验结束称量腹侧前列腺、精囊和凝结腺、肛提肌(LA)加球海绵体肌、阴茎头和尿道球腺重量,并测定促黄体激素(LH)和T。 结果:受体竞争结合试验荧光偏振的最大值和最小值的差值为111mP,E_2的IC50为22nM。在E-SCREEN实验中,2.5μM的雌二醇组OD值比对照组升高并达到统计学显著性水平。卵黄蛋白原测定结果显示,和亲本鲤鱼相比,转入生长激素基因的鲤鱼生长激素水平无明显变化。类固醇合成(睾丸切片法)试验:各组的睾酮水平随培养时间增加而增加,其中每组的hCG激发均比无hCG亚组的睾酮水平高,AMI+hCG组平均T浓度低于hCG激发对照组,FIN组和对照组相比无显著性差异。啮齿动物子宫试验:E2组子宫干重、湿重及其脏器系数显著升高;E2组的卵巢、子宫和阴道病理学均为显著增生改变;1.0g/kg bw白藜芦醇剂量组的子宫轻度增生,0.3、0.6和1.0g/kg bw白藜芦醇剂量组的阴道轻度增生无剂量-反应关系。Hershberger试验:TP+FLU组和TP组相比,前列腺、精囊腺、阴茎、肛提肌/球体海绵体肌、尿道球腺等重量明显降低;TP+FLU组和TP组相比,LH水平明显升高,LH/T比值明显升高。 结论:本研究成功建立了体外和体内筛选方法,有效利用这两类方法,分别从不同的水平筛选内分泌干扰物,即有助于提高筛选效率、结余筛选成本,更有助于提高筛选的灵敏性和特异性。体外筛选模型包括:受体结合试验、E-SCREEN、类固醇合成筛选试验;体内筛选模型包括:啮齿类动物子宫试验;HERSHBERGER试验。 第二部分:大豆异黄酮安全性评价研究 目的:对大豆异黄酮(SIF)的毒理学安全性进行研究和评价,并重点针对内分泌干扰毒性进行系统研究;同时探索大豆异黄酮的毒理学机制,为大豆异黄酮作为食品资源的合理应用提供科学依据。 方法:急性毒性试验选用Sprague Dawley(SD)大鼠,以SIF为受试物,采用最大耐受量(MTD)法,实验剂量为10 g/kg BW。 遗传毒性试验:Ames试验以染料木素(GEN)为受试物,设置0.008、0.04、0.2、1.0、5.0 mg/皿的5个剂量水平;小鼠(KM)精子畸形(包括精子线粒体获能试验)试验和小鼠骨髓细胞微核试验以SIF为受试物,试验设置0.2、0.5、1.5和4.5 g/kg BW四个剂量水平。 内分泌干扰毒性试验:E-SCREEN试验以GEN为受试物(剂量分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.016、0.008和0.004 mM);啮齿动物子宫试验以SIF和GEN为受试物,SIF剂量分别为0.1、0.2、0.5和1.5 g/kg BW,GEN剂量分别为0.05、0.1、0.25和0.75 g/kg BW;HERSHBERGER试验选用SD大鼠,以SIF为受试物,剂量分别为0.2、0.5、1.5和4.5 g/kg BW。 亚慢性毒性试验:选用SD大鼠,连续13周灌胃给予SIF,剂量分别为0.2、0.5、1.5和4.5 g/kg BW剂量,每周观察动物的活动情况,并记录体重和进食量,试验结束后测定尿常规、血液学、血生化、凝血功能、内分泌指标(包括总睾酮、雌二醇、甲状腺素和促甲状腺素)、DNA损伤(彗星试验),脏器组织病理观察和核增值因子以及雌激素受体的免疫组织化学分析。 结果和结论:大鼠急性毒性试验:SIF对雌、雄性大鼠的MTD大于10.0g/kgBW,因此大豆异黄酮属于实际无毒物。 三项遗传毒性试验:Ames试验:未见SIF有致基因突变作用;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验:SIF对小鼠体细胞染色体无致断裂作用;小鼠精子畸形和精子活力试验:SIF对小鼠精子畸形发生率无影响,4.5 g/kg剂量组红色荧光精子所占比例明显降低。因此本研究未见SIF遗传毒性,但是4.5 g/kg BW SIF抑制精子线粒体获能。 内分泌干扰毒性研究:E-SCREEN试验:0.0625 mM剂量组OD值明显增高:子宫增重试验:与对照组比较,SIF和GEN剂量组子宫重量和脏器系数显著增加,GEN和SIF 4个剂量组的阴道均为增生改变:HERSHBERGER试验:与对照组比较,1.5和4.5 g/kg SIF剂量组的阴茎头/肾脏、尿道球脂/肾脏以及4.5g/kg剂量组肛提肌/肾脏均明显降低;和TP组相比,1.5 g/kg组的LH/T明显升高。因此SIF具有雌激素样活性,1.5 g/kg BW和4.5 g/kg BW SIT产生间接抗雄激素作用并降低大鼠的体重。 亚慢性毒性试验:1.5和4.5 g/kg剂量组体重增长明显滞后于对照组体重;进食量从第1周开始雄性1.5和4.5 g/kg剂量组的进食量明显低于对照组;血常规和尿常规均无明显变化:雌性1.5和4.5 g/kg的CHO和LDL-C和4.5 g/kg的HDL-C明显降低,0.2、0.5和1.5g/kg剂量组的HDL-C/LDL-C明显升高。雄性4个受试物剂量组的TO明显低于对照组,4个剂量组的HDL-C明显高于对照组。尿常规未见明显变化。雌性大鼠4.5 g/kg BW剂量组T3和T3/T4明显高于对照组,TSH/T4和TSH/T3各受试物具有下降的趋势。雄性大鼠0.5、1.5和4.5 g/kg BW剂量组总睾酮明显低于对照组;4.5 g/kg剂量组的宰杀体重、肝脏、肾脏、心脏和附睾重量以及1.5 g/kg剂量组的心脏重量均明显低于对照组,4.5 g/kg饲喂大鼠90天后雌性动物阴道壁增厚、上皮增生,雄性动物乳腺发育并泌乳:雌性大鼠各剂量组外周血淋巴细胞彗星试验的彗星惯量、彗星分布矩和尾惯量均比对照组降低:雌性4.5g/kg剂量组阴道上皮细胞PCNA的表达水平和ER-α表达水平高于对照组。因此SIF的毒性具有性别差异,体现为对雌性大鼠:影响血生化的脂类指标(降低胆固醇水平),降低DNA的氧化损伤,高剂量SIF(4.5 g/kg BW)干扰甲状腺素水平,导致阴道增生,NOAEL为1.5 g/kg BW;对雄性大鼠:SIF影响血生化的脂类代谢指标降(甘油三脂水平),降低体重,降低睾酮水平,促进乳腺增生并泌乳,NOAEL为0.2 g/kg BW。
【学位授予单位】:中国疾病预防控制中心
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R155.5

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