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二价金属离子对PrP生物学活性的影响以及CytoPrP促进微管解聚导致细胞凋亡的研究

李晓丽  
【摘要】: 可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)即朊病毒病(prion diseases),是一类罕见的致死性神经系统退行性疾病,包括人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、GSS综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病、家族性致死性失眠症(fatal familial insomnia, FFI)、绵羊和山羊的瘙痒病(scrapie),牛及其它动物的海绵状脑病等,根据疾病的来源不同可分为自发形成(散发型)、遗传型和医源型三种形式。本文分为三部分,第一部分我们利用原核表达系统表达了全长人PrP以及各种PrP八肽重复区突变体,采用蛋白酶消化、沉淀实验、聚集实验以及圆二色谱(CD)等方法探讨了锰离子对野生型PrP以及各中八肽重复突变体生物学特性的影响。第二部分采用pull-down实验和免疫共沉淀方法探讨了PrP51-91和微管蛋白之间的相互作用。并且我们通过共沉淀法、比浊法及免疫荧光检测PrP51-91与铜离子对微管蛋白聚合的影响。此外,再通过共聚焦显微镜以及MTT法检测PrP51-91与铜离子对细胞中微管以及细胞毒性的影响。第三部分我们在分子水平证实了细胞内PrP (CytoPrP)与微管间的相互作用,并进一步确定CytoPrP对微管的影响能导致的细胞凋亡。 第一部分:锰离子对PrP生化特性的影响研究 锰离子可能在朊病毒的发病过程中起一定作用。我们利用锰离子处理野生型PrP和PrP八肽重复序列突变体后。通过PK消化、透射电镜、沉淀实验以及圆二色谱法分析锰离子对各种重组PrP生化特性的影响情况。为了检测锰离子能否影响野生型PrP和PrP八肽重复序列突变体的PK抗性,我们利用不同浓度的PK酶对经锰离子处理后的PrP进行消化,通过Western blot进行PK抗性检测。结果显示,经锰离子处理后,野生型PrP和PrP突变体的PK抗性均增强,并且PrP八肽重复序列突变体增强程度要强于野生型PrP。为了检测锰离子能否影响野生型PrP和PrP八肽重复序列突变体聚集,我们利用透射电镜、比浊法以及沉淀实验对其进行检测。结果显示,经锰离子处理后,野生型PrP和PrP突变体更容易发生聚集,并且PrP八肽重复序列突变体比野生型PrP更容易发生聚集。为了检测锰离子对野生型PrP和PrP八肽重复序列突变体二级结构的影响。我们利用圆二色谱法对其进行观察。结果显示,经锰离子处理后,野生型PrP和PrP突变体p-折叠的含量明显增加,并且PrP八肽重复序列突变体p-折叠的含量增加幅度明显高于野生型PrP增加的幅度。这些结果提示,锰离子能增强PrP的PK抗性,使其更容易发生聚集,使其由以α螺旋为主变为以β-折叠为主,而且锰离子对PrP的作用强度与八肽重复区的数目有关。锰离子可能作为一种辅助因子参与PrPC到PrPSc的转变。 第二部分:PrP51-91促进微管聚集并拮抗铜离子的微管解聚作用 我们通过免疫共沉淀以及pull down实验显示原核表达的PrP八肽重复序列能与微管蛋白形成复合物,提示PrP八肽序列能与微管蛋白发生相互作用。为了检测PrP八肽重复序列与tubulin的相互作用能否影响微管的聚集,我们利用体外微管聚集实验、共沉淀实验对其进行检测。结果显示,PrP八肽重复序列能促进微管发生聚集。为了检测PrP八肽重复序列能否抵抗铜离子导致的微管解聚作用,我们利用比浊法、免疫荧光对其进行检测。结果显示,铜离子能使微管发生解聚作用,PrP八肽重复序列则能抵抗铜离子所引起的微管解聚作用。为了检测PrP八肽重复序列以及铜离子对细胞中微管以及细胞活性的影响,我们利用共聚焦显微镜以及MTT法对其进行观察。结果显示,铜离子能使细胞中微管发生解聚,而PrP八肽重复序列则能抵抗铜离子所引起的微管解聚。此外,铜离子对细胞的毒性可能与其促进微管解聚有关,PrP八肽重复序列先于或者同时与铜离子作用细胞能拮抗铜离子引起的细胞毒性作用。 第三部分:CytoPrP能使微管发生解聚而导致细胞凋亡 我们将HeLa细胞转染CytoPrP,利用免疫共沉淀实验确定在细胞中CytoPrP能与微管发生相互作用。我们再利用共聚焦显微镜进一步确定CytoPrP能与微管在细胞中能发生共定位。为了检测CytoPrP与tubulin的相互作用能否影响微管的聚集,我们利用共聚焦显微镜以及Western blot对其进行检测。结果显示,CytoPrP能抑制细胞内微管发生聚集,并且使细胞内微管蛋白含量减少。为了检测CytoPrP所引起的细胞凋亡是通过微管解聚引起的,我们利用MTT以及Annexin V/PI双染方法对其进行检测。结果显示,CytoPrP能使细胞发生凋亡并且使其发生凋亡是通过促进微管解聚引起的。这些结果提示,CytoPrP与微管发生相互作用后,促进微管发生解聚,从而导致细胞凋亡。


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