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《中国中医科学院》 2012年
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补肾活血方对hPTH(1-34)干预下成骨细胞的影响及其治疗肾性骨病患者的远期疗效观察

林越  
【摘要】:肾性骨病(ROD)是由慢性肾脏疾病及终末期肾脏疾病引起的体内矿物质和骨代谢系统紊乱的一组临床症候症,它是慢性肾功能衰竭(CRF)常见、严重、治疗困难的并发症。当肾小球滤过率GFR10ml/min时,几乎100%的CRF患者都会发生ROD。 高转运肾性骨病是三种肾性骨病中最常见的骨病类型。高转换型肾性骨病的主要原因是继发性甲旁亢,甲状旁腺激素(PTH)分泌亢进,过量的PTH使骨重建过程的吸收和生成两种功能均亢进,成骨、破骨细胞异常增生活跃,而当破骨细胞增生大于成骨细胞,最终骨吸收大于骨形成,形成骨病。而成骨细胞与破骨细胞之间信息交流的分子基础是成骨细胞表达的骨保护素(OPG)及其配体(RANKL)和破骨细胞表达的NF-kB的活化受体(RANK),即OPG/RANKL/RANK系统,PTH对其有调控作用。 目前西医对ROD主要采取对症治疗,包括饮食治疗、磷结合剂、活性维生素D类似物的应用、合理调整血钙、磷、iPTH水平、钙敏感受体激动剂的应用及透析方式的调整,虽能部分改善肾性骨病患者的临床症状,但临床远期疗效并不理想,可能导致软组织异位钙化,引发心脑血管并发症发生率增加,且存在药物价格昂贵等多个问题。中医从“肾主骨”理论出发,根据肾性骨病脾肾衰惫为本、浊瘀内阻为标的基本病机,以补肾活血为大法,自拟补肾活血方(主要组成:熟地、川断、狗脊、补骨脂、丹参、大黄、当归)治疗肾性骨病。以期通过调节骨代谢平衡,改善甲旁亢作用,发挥其治疗作用。 1、研究目的 本课题研究分为实验研究和临床研究两部分。 实验研究目的在于通过体外模拟肾性骨病继发性甲旁亢状态,以人类重组甲状旁腺激素(hPTH)干预的小鼠成骨细胞为研究对象,观察补肾活血含药血清对其增殖、分化的影响及其对OPG及RANKL基因表达的影响,以探讨补肾活血中药治疗肾性骨病的分子水平机制。 临床研究则以随访形式追踪观察曾经入组的服用补肾活血颗粒肾性骨病患者,从心血管并发症、终点事件、骨代谢水平、生存质量及营养状况方面评定补肾活血方的远期临床疗效,更为临床采用中医药治疗肾性骨病提供相对客观评价依据。 2、研究方法 2.1实验方法 ①培养成骨细胞MC3T3-E1,配制终浓度为10ng/ml的hPTH(1-34)溶液作为体外模拟甲旁亢的干预条件,制备中药、西药及正常鼠含药血清,实验分组。 ②用MTT法在细胞培养的24h、48h、72h分别检测不同浓度补肾活血方组对hPTH(1-34)干预下MC3T3-E1增殖的作用。 ③用ELISA方法在细胞培养的24h、48h、72h分别检测不同浓度补肾活血含药血清组细胞在hPTH (1-34)干预下其上清液中PICP和ALP分泌水平。 ④采用实时荧光定量PCR法在8h、12h、24h时,对PTH干预下的的小鼠成骨细胞的OPGmRNA、RANKLmRNA的表达进行绝对定量分析。 2.2临床研究方法 本研究以2008年10月-2009年3月期间曾经参与“补肾活血法改善肾性骨病病人生存质量及骨代谢异常临床研究”课题的维持性血液透析肾性骨病患者为研究对象,治疗组及对照组则根据当时是否接受中药干预治疗划分,其中对照组采取规律活血颗粒。采用病例对照研究的血透、常规补钙降磷等基本治疗,而治疗组则是在基本治疗基础上加以口服补肾方法,追踪观察两组患者3年。临床观察指标主要包含两部分,一为回顾性记录3年中骨化三醇冲击治疗次数、心脑血管发生率、一年及三年生存率、终点事件发生率;另一为评估在3年观察终位时间点时生存质量评分、营养状况评分,甲状旁腺激素水平、钙、磷等骨代谢指标、肾功能指标、钙、磷及钙磷乘积达标率,将两组观察指标进行比较。所得数据使用SPSS16.0软件进行统计学处理,正态分布的计量资料采用t检验,非正态分布计量资料采用秩和检验,描述性计数资料采用卡方检验。 3、结果 3.1实验研究部分 3.1.1各组细胞增殖水平的比较:随时间增加,中药各浓度组细胞增殖水平明显上升,而模型PTH组则从48h增殖率开始下降,当达到72h时,模型PTH组0D值明显低于正常组(P0.05),而各浓度中药组细胞增殖水平均显著高于模型PTH组(P0.01),且增殖水平呈剂量依赖性,即浓度越高增殖水平也越高。 3.1.2各组ALP、PICP分泌量的比较:①自48h始至72h,各浓度中药含药血清组ALP分泌量均显著高于模型PTH组(P0.01);②而中药高浓度组在72h时PICP分泌量显著高于模型PTH组(P0.01)。 3.1.3各组OPGmRNA及RANKLmRNA表达水平的比较:①在经一定浓度(lOng/ml)的PTH持续刺激后,成骨细胞OPGmRNA表达先是出现略微增高趋势,之后开始出现表达抑制,至24h时OPGmRNA表达明显抑制,表达量与正常组相比显著减少,有统计学差异(P0.01);另一方面,随时间延长RANKL表达量则呈不断上升趋势,且各个时间点均较正常组RANKL水平明显升高,有显著性差异(P0.01),表明PTH能明显上调RANKLmRNA的表达;②补肾活血各浓度组及西药骨化三醇组随时间延长,OPGmRNA水平逐渐升高,促进其表达,至24h时达到高峰;且各个时间点均较模型PTH组OPGmRNA水平增高,中药组呈剂量依赖性,即补肾活血含药血清浓度越高,OPGmRNA表达量也越高;③补肾活血各浓度组及西药骨化三醇组RANKL表达量随时间延长呈递增趋势,但从12h起,各组RANKL表达量均较模型组减低,且差异有显著性(P0.01),至24h时,各组RANKL表达量仍较模型组低,且P0.05,有显著性差异。中药各浓度组中,高浓度组RANKL表达量最低,中浓度组次之,低浓度组最高。西药骨化三醇在各个时间点RANKL表达量则与补肾活血中浓度组近似。 3.2临床研究部分 3.2.1骨化三醇冲击治疗率:治疗组骨化三醇冲击治疗率明显低于对照组(P0.05),但治疗组运用骨化三醇冲击治疗的频次与对照组总体无显著性差异。 3.2.2心血管并发症发生率:两组的心梗、脑梗、心绞痛及心律失常发生率虽无显著性差异(P0.05),但治疗组急性心衰发生率明显低于对照组(P0.01),且心绞痛发生频次也明显低于对照组,有显著性差异(P0.05) 3.2.3终点事件:两组骨折发生率均较低,两组间比较无显著性差异(P0.05);两组间一年生存率相比无显著性差异,而三年生存率则有显著性差异,治疗组优于对照组(P0.05);两组患者的死亡原因主要为心脑血管疾病和感染。 3.2.4骨代谢指标:治疗组iPTH、血磷水平均显著低于对照组(P0.05),血钙水平两组间比较无显著性差异(P0.05);治疗组钙磷乘积达标率明显高于对照组(P0.05),结果有显著性差异。 3.2.5肾功能指标:两组血肌酐及尿素氮水平相比,P均0.05,无显著性差异。 3.2.6生存质量:①八个维度比较:治疗组在生理机能(PF)和总体健康(GH)得分高于对照组,并有统计学差异(P0.05),表明治疗组在生理机能(PF)和总体健康(GH)方面优于对照组;而生理职能(RP)、躯体疼痛(BP)得分与对照组相比则无显著性差异;治疗组一般精力(VT)和精神健康(MH)方面得分均高于对照组(P0.01),有极显著性差异,表明治疗组患者一般精力及精神健康方面均明显优于对照组;而治疗组在社会功能(SF)及情感职能(RE)方面,评分也均高于对照组(P0.05),有统计学差异,治疗组患者社会功能和情感职能也较对照组好。②在生理健康(PCS)总得分方面,治疗组评分高于对照组,P0.01,有极显著性差异,说明治疗组生理健康优于对照组;而治疗组心理健康总得分(MCS)高于对照组,P0.01,有极显著性差异,治疗组心理健康也优于对照组。③治疗组SF-36总分高于对照组,P0.05,有显著性差异。 3.2.7营养状况:治疗组存在营养风险人数12人(25.5%),而对照组则有20人(47.6%),两组相比,治疗组存在营养风险人数比低于对照组,P0.05,有统计学差异。说明治疗组患者营养状况较对照组好。 4、结论 4.1补肾活血方含药血清能改善甲旁亢作用下成骨细胞的骨代谢作用,在促进hPTH (1-34)干预下小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖的同时,也能很好地促进其进一步分化成熟,进而促进成骨细胞骨形成,且促进效应呈浓度依赖性。 4.2补肾活血方含药血清能上调PTH干预下OPGmRNA的表达,降低PTH干预下RANKLmRNA的高表达,提示补肾活血方可能通过很好地促进骨形成,抑制甲旁亢引起的过度骨吸收作用机制来改善骨代谢平衡。并且中药浓度越高,促进骨形成作用越明显,反之,中药浓度越高抑制骨吸收作用也最强。补肾活血方组在体外调整骨代谢作用与西药骨化三醇相近。 4.3补肾活血方能减少骨化三醇冲击治疗率,降低iPTH、高血磷水平,提高钙磷乘积达标率,并能改善ROD患者生存质量及营养状况,减少心血管并发症发生率,提高生存率,提示补肾活血方治疗肾性骨病患者远期疗效好。 5、创新点 5.1关于肾性骨病实验研究模型的造模方法多采用大鼠部分肾切除加高磷饮食,本课题实验研究则从微观入手,采用直接给予小鼠成骨细胞一定浓度PTH持续刺激的方法进行造模,在体外模拟甲旁亢状态,此造模方法国内外文献未见报道; 5.2观察补肾活血方能改善PTH干预下的OPG及RANKLmRNA的表达,从细胞分子生物学水平上评价补肾活血方促进骨形成,抑制过度骨吸收,改善骨代谢的作用; 5.3采用了目前最前沿的实验方法Realtime-PCR法检测小鼠成骨细胞中OPGmRNA及RANKLmRNA表达量,较以往普通PCR法更加灵敏、准确,而且使用了实时荧光定量中的Taq man探针法建立标准曲线对基因表达做到准确定量; 5.4首次对肾性骨病患者进行远期疗效观察,补充以往肾性骨病临床研究中没有的项目:包括心血管并发症、骨化三醇冲击治疗次数、实验室检查、生存质量评分、营养状况、终点事件等,并引入生存曲线概念,以评定补肾活血方的远期疗效,目前未见有中药方治疗肾性骨病远期疗效观察的相关临床报道。
【学位授予单位】:中国中医科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R277.5

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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 鞠小妍;血液透析患者肾性骨病单中心横断面研究[D];青岛大学;2010年
2 张雪;“肾主骨”与肾形骨病的理论初探[D];北京中医药大学;2010年
3 田辉;强骨益肾颗粒治疗肾性骨病的疗效观察[D];湖南中医药大学;2012年
4 李宁;肾性骨病中医证候特征与血PTH水平及PTH受体基因表达相关性的研究[D];中国中医科学院;2010年
5 马驰;肾性骨病患者中医证候特征与透析龄、原发病及其生存质量的相关性研究[D];北京中医药大学;2012年
6 高婷;90例慢性肾衰竭并肾性骨病的证候演变规律初探[D];湖北中医学院;2006年
7 崔莉;不同透析方式对肾性骨病相关因素的影响-P、Ca、PTH、ALP、β_2-MG[D];暨南大学;2010年
8 卞维静;甲状旁腺激素、骨转运生化指标及维生素D在肾性骨病诊断中的意义[D];中国协和医科大学;2008年
9 江建青;慢性肾脏病患者骨代谢临床指标的研究[D];天津医科大学;2007年
10 马俊杰;补肾活血方治疗肾精亏损型耳鸣的实验研究[D];南京中医药大学;2010年
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