针刺对下丘脑促性腺激素释放激素神经元的调节规律及机制

【摘要】： 1目的 探讨针刺治疗生殖内分泌疾病的特异规律性的穴位及其在动情周期不同阶段对生殖内分泌功能的调节规律。为进一步提高针灸疗效、完善疗效机制提供科学实验依据，并指导临床规范化选穴。 2方法 实验采用雌性有正常动情周期的Sprague-Dawley处女大鼠260只，体重240±40g，在氨基甲酸乙酯(10％，1.0-1.2g／kg)麻醉状态下进行。动情周期是根据阴道脱落细胞的HE染色判断。实验过程分4部分进行。实验数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示。 2．1电生理部分 实验动物32只，其中动情间期／动情后期：18只，动情前期／动情期：14只。 (1)鉴定下丘脑特异分泌促性腺激素释放激素(GnRH)神经元的方法 用充灌10％辣根过氧化酶的1M氯化钾的玻璃微电极(尖端约0.5-1μm，阻抗约10-15MΩ)细胞外记录下丘脑内侧视前区、弓状核、室旁核神经元放电活动。当记录到神经元放电30s后，给以“触摸阴蒂”刺激(性唤起刺激)，观察记录到的神经元对这种模拟性刺激的反应。 如果神经元放电在模拟性刺激后增强或减弱，再经颈外静脉分别注射雌二醇(30-50ng／kg)、睾酮(8mg／kg)、氢化可的松(20mg／kg)，观察不同激素能否产生反馈性调节作用，进一步鉴定神经元的属性。如果注射雌二醇、睾酮后神经元放电减弱，注射氢化可的松神经元放电无明显改变，初步认为该神经元就是下丘脑与性唤起刺激相关神经元。再用正电泳电流电泳辣根过氧化酶(HRP)标记该神经元(50V，10Hz／次脉冲方波，30min)，3h后用4％多聚甲醛和1.25％戊二酸灌流，脱水，冰冻切片制作，进行TMB染色和GnRH免疫组化染色分析，探讨记录的神经元是否是下丘脑GnRH神经元。 (2)遴选针刺调节生殖内分泌功能的有效穴位 充灌2％旁胺天蓝(Pontamine sky btue)的0.1M醋酸钠的玻璃微电极(尖端约0.5-1μm，阻抗约10-15MΩ)寻找下丘脑与性唤起刺激神经元，并以该神经元放电为指标，比较针刺身体不同部位的8个穴位：内关、膻中、厥阴俞、中脘、肾俞、关元、子宫、足三里30s对这类神经元的激活效应，并比较最有效的部位、穴位。 单细胞记录采用玻璃微电极及铂金电极，在隔离屏蔽内进行。神经元电活动经微电极输入DAM50(美国WPI公司)微电极放大器后引入CED系列MICR01401Ⅱ(500KHz 16-bit ADC)信号采集装置，将模拟信号转换为数字信号传输给计算机，经Spike2计算机信号分析系统(England CED公司，CB40FE)对数字信号进行分析。 2．2卵巢-体表相关性与穴位关系的研究 实验动物13只，随机分两个组：芥子油注射组(8只)和0.9％生理盐水注射组(5只)。芥子油注射组在大鼠左侧卵巢内注射0.08ml(10％)芥子油，制造一个“卵巢炎症”模型，并在尾静脉注射伊文氏兰0.25ml(浓度50mg／ml，按每100g体重5mg)，通过C类纤维的轴突反射，诱发出伊文氏兰的渗出。研究血浆渗出点在皮肤的分布区域(敏感穴区)与支配卵巢功能的脊髓神经节段及特异激活下丘脑与性唤起刺激相关神经元的穴位之间的关系。并与卵巢注射0.9％生理盐水0.08ml的雌鼠对比。 2．3针刺对GnRH在脑中枢免疫反应表达的影响 实验动物72只，随机分为三个组：对照组(24只)、关元组(24只)、内关组(24只)，每组中都有动情间期、动情前期、动情期、动情后期的大鼠(根据阴道涂片确定)。电针治疗在早晨9：30开始持续30min(疏密波，频率20-60Hz，强度2-3mA)，下午15时断头取脑组织。通过免疫组化染色观察GnRH在脑中枢的分布及针刺前、后GnRH在脑中枢特定部位的表达有何变化。 2．4针刺对外周血GnRH、LH、E2水平的调节 (1)实验动物104只，随机分为三个组：对照组(32只)、关元组(36只)、内关组(36只)，每组中都有动情间期、动情前期、动情期、动情后期的大鼠(根据阴道涂片确定)。电针治疗在早晨9：30开始持续30min(疏密波，频率20-60Hz，强度2-3mA)。分别在针刺治疗前、电针30 min、出针30 min(Omin、30min、60min)从髂外静脉采集静脉血进行GnRH和黄体生成素(LH)放射免疫检测。比较外周血GnRH、LH水平的变化。 (2)实验动物24只，随机分为2个组：损毁组(损毁正中隆起)(12只)和假损毁组(12只)，比较电针关元(CV4)穴对损毁组和假损毁组外周血中GnRH、LH和雌二醇(E2)的调节规律。 3结果 (1)在下丘脑内侧视前区、弓状核、室旁核附近记录到了与“性唤起”刺激相关神经元，内侧视前区最多，其次为弓状核、室旁核。经HRP示踪标记及GnRH免疫组化染色结果显示：HRP示踪标记的与“性唤起”刺激相关神经元，几乎是与GnRH免疫反应阳性表达的部位重叠的。 (2)针刺后下丘脑与“性唤起”刺激相关神经元放电增加的百分率按穴位所在部位的脊髓神经节段由上到下的顺序：内关(PC6)、膻中(CV17)、厥阴俞(BL14)、中脘(RN12)、肾俞(BL23)、关元(CV4)、子宫(Ex-CA1)、足三里(ST36)，在动情前期／动情期雌鼠依次为122.59％、124.68％、205.67％、204.68％、246.58、341.76％、444.15％、291.57％；在动情间期／动情后期雌鼠依次为77.85％、107.8l％、117.37％、202.39％、212.39％、473.24％、450％、299.68％。 从针刺部位来看下丘脑与“性唤起”刺激相关兴奋性神经元电活动增加的百分率由大到小的顺序为：下腹部(脐以下)＞下肢、下背部(L1-S5)＞上腹部(剑突-脐)、背部(T12以上)＞胸部(剑突以上)、上肢。针刺关元(CV4)、子宫(Ex-CA1)、足三里(ST36)下丘脑GnRH神经元放电增加的百分率较其他穴位高。 (3)伊文氏兰检测出的敏感穴区分布在支配卵巢功能的脊髓神经节段，所对应的穴位正是特异激活下丘脑与性唤起刺激相关神经元的穴位。 ①渗出点在体表的分布：芥子油注射组明显多于盐水注射组。从芥子油注射组大鼠渗出点的分布情况看：T_(13)-L_2皮肤血浆渗出点分布最多，腹部较背部分布集中。皮肤血浆渗出点在不同脊髓神经节段分布由多到少的顺序为：T_(13)-L_2＞L_6-S_2＞T_(10)-T_(12)＞L_3-L_5。盐水注射组亦有极少量分布，但无规律性，可能与个体差异有关。渗出点在躯体大体分布为：下腹部(脐以下)、腹股沟、会阴、下背部(T_(13)以下)、尾巴近端、小腿等处。 ②皮肤血浆渗出点在身体的左、中、右侧均有分布，以左侧分布最多。渗出点在芥子油注射组和生理盐水注射组的腹部分布在左侧的分别为：3.88±0.40、0.6±0.24个／只，分布在中间的：1.63±0.18、0.40±0.25个／只，分布在右侧的：1.00±0.19、0个／只；背部分布在左侧的渗出点分别为：3.63±0.26、0.8±0.8个／只，分布在中间的：1.63±0.26、0个／只，分布在右侧的：0.87±0.23、0个／只；两组渗出点在各个部位相比均有显著性差异(P＜0.05)。 ③渗出点分布比较集中的几个部位可以与几个针灸穴区相对应：关元(CV4)-子宫(Ex-CA1)穴区、肾俞(BL23)-命门(DU4)穴区、长强(DU1)-会阴(RN1)穴区、三阴交(SP6)-足三里(ST36)穴区、中脘(RN12)穴区、肝俞(BL18)穴区。各穴区渗出点分布的平均值分别为：3.88±0.30、3.25±0.25、2.25±0.37、1.63±0.26、0.75±0.16、0.75±0.16。结果显示：关元-子宫穴区渗出点分布最密集，与其他穴区相比：除肾俞-命门穴区外均有显著性差异(P＜0.05)，肾俞-命门穴区与关元-子宫穴区渗出点分布比较接近。 (4)免疫组化染色结果显示：下丘脑内侧视前区、弓状核、室旁核及隔区、杏仁核等部位GnRH免疫反应的表达较明显，且动情周期不同阶段GnRH免疫反应的表达不同。根据着色的深浅及灰度值的不同分为“强、中、弱”的表达。单位面积是指实际切片面积的0.05mm~2。 ①对照组在同一解剖部位：动情周期不同阶段GnRH免疫反应表达的总数量不同。在内侧视前区：动情间期、动情前期、动情期和动情后期的GnRH免疫反应表达分别为：400±2.33、431±3.12、457±2.65、386±4.11阳性反应个数／单位面积；其中GnRH“强”免疫反应表达分别为：53±6.61、88±4.16、94±3.65、57±3.11阳性反应个数／单位面积，动情前期和动情期GnRH“强”免疫反应表达明显多于动情间期和动情后期。 ②针刺后在动情周期不同阶段GnRH免疫反应的表达在上述核团均有不同程度的增加。尤其在动情间期和动情后期表现明显。 动情周期的相同阶段，关元组、内关组和对照组GnRH免疫反应表达的总数量相差不明显，但其中GnRH“强”免疫反应表达的数量三个组之间有显著性差异，关元组表达最多。 在内侧视前区：针刺后关元、内关组GnRH免疫反应表达的总数量分别为：动情间期：424±3.17、420±4.32阳性反应个数／单位面积；动情前期：427±2.73、440±4.18阳性反应个数／单位面积；动情期：468±3.46、458±1.78阳性反应个数／单位面积；动情后期：440、425阳性反应个数／单位面积。其中GnRH“强”免疫反应表达的数量分别为：动情间期：92±4.76、75±3.53阳性反应个数／单位面积；动情前期：1.06±5.20、96±5.49阳性反应个数／单位面积；动情期：119±4.86、102±7.74阳性反应个数／单位面积；动情后期：95±6.32、76±3.07阳性反应个数／单位面积。 关元组与对照组相比在动情间期、动情前期、动情期、动情后期GnRH“强”免疫反应表达增加的百分率分别为：73.5896、20.4596、30.85％、66.87％。可以看出动情间期和动情后期的GnRH“强”免疫反应表达的增加程度较动情前期和动情期明显。 其它部位包括弓状核、室旁核及隔区、杏仁核等部位GnRH免疫反应的表达规律与内侧视前区相似。GnRH免疫反应表达的数量内侧视前区＞弓状核＞室旁核＞隔区、杏仁核。 (5)在观察针刺对外周血GnRH、LH水平调节作用的过程中，发现针刺后30min在动情周期各阶段GnRH、LH水平均有增高的表现，60min有不同程度的回降(与30min相比)。 ①从对照组观察实验的三个时间点：GnRH的水平在0min、30min、60min分别是：动情间期：42.38±2.23、42.60±3.11、46.55±2.58皮克／ml，动情前期：46.37±2.53、44.40±3.47、48.86±2.92皮克／ml，动情期：51.88±3.02、43.47±3.75、51.41±4.77皮克／ml，动情后期：44.26±5.14、44.58±2.93、42.93±1.93皮克／ml。可以看出：在0min GnRH的水平在动情期相对其他周期高；动情前期、动情期在三个时间点GnRH的水平相对动情间期、动情后期在三个时间点GnRH的水平相差大。 LH的水平分别是：动情间期：58.66±7.11、54.46±2.32、57.29±5.46 mIU／ml，动情前期：68.65±4.65、62.75±4.60、61.45±4.95 mIU／ml，动情期：61.01±6.02、54.46±4.43、57.61±3.91 mIU／ml，动情后期：55.22±3.22、55.48±2.81、53.61±5.85mIU／ml，可以看出：LH的水平在动情前期相对其他周期高；动情前期、动情期在三个时间点LH的水平相对动情间期、动情后期在三个时间点LH的水平相差小。 ②针刺对GnRH分泌的促进作用：电针关元(CV4)穴GnRH水平在0min、30min、60min三个时间点分别是：动情间期：41.22±4.90、57.22±4.21、53.30±6.41皮克／ml，动情前期：46.94±7.10、55.50±3.98、47.40±6.90皮克／ml，动情期：49.78±3.92、54.13±4.03、51.32±2.82皮克／ml，动情后期：46.42±2.58、56.58±1.73、50.62±4.45皮克／ml。 电针内关穴(PC6)GnRH水平在0min、30min、60min三个时间点分别是：动情间期：41.76±2.73、47.86±4.09、43.83±2.56皮克／ml，动情前期：46.98±3.54、46.70±1.93、45.38±2.67皮克／ml，动情期：50.40±3.75、52.20±1.57、50.16±1.59皮克／ml，动情后期：47.95±2.32、51.77±5.01、47.98±5.54皮克／ml。 经统计学分析：在30min动情间期和动情后期关元(CV4)穴组与对照组同阶段相比有显著性差异(P＜0.05)，虽然针刺内关穴(PC6)组亦有相应的增高趋势，但与对照组之间无显著性差异(P＞0.05)；从针刺关元(CV4)穴组与内关穴(PC6)组两组效应来看，电针关元(CV4)穴是有比内关穴(PC6)更好的促进GnRH分泌的功能。 进一步比较电针关元(CV4)在动情间期、动情前期、动情期、动情后期GnRH水平在0min、30min的变化，结果显示：只有动情后期在0min、30min GnRH水平相比有显著性差异(P＜0.05)。动情间期、动情前期、动情期虽然GnRH水平在30min时较0min高，但与0min时相比无显著性差异(P＞0.05)。 ③针刺对LH分泌的调节作用：电针关元(CV4)穴LH水平在0min、30min、60min三个时间点分别是：动情间期：57.27±1.89、69.17±3.72、66.75±4.75活性单位／ml，动情前期：72.50±3.35、77.19±2.70、70.18±6.36活性单位／ml，动情期：63.95±5.59、71.53±5.55、68.41±7.31活性单位／ml，动情后期：60.27±4.27、70.36±4.53、64.38±4.98活性单位／ml。 电针内关穴(PC6)LH水平在0min、30min、60min三个时间点分别是：动情间期：56.78±3.08、58.70±5.11、61.11±4.07活性单位／ml，动情前期：72.92±3.96、66.96±3.61、66.33±4.60活性单位／ml，动情期：61.97±5.86、60.42±5.83、57.97±4.15活性单位／ml，动情后期：57.41±4.12、60.07±5.32、54.36±5.45活性单位／ml。 结果显示：针刺关元(CV4)穴和内关穴(PC6)30min血液中的LH水平较动情周期相同阶段对照组均有升高的趋势。经统计学处理：关元穴(CV4)组与对照组相比在各期均有显著性差异(P＜0.05)，而针刺内关穴(PC6)组在30min时虽然亦有相应的增高，但与对照组之间无显著性差异(P＞0.05)。比较电针关元穴(CV4)组与内关穴(PC6)组两组效应，关元穴(CV4)比内关穴(P6)有更好的促进LH水平的功能。 进一步比较电针关元(CV4)0min、30min在动情间期、动情前期、动情期、动情后期对LH的调节作用，结果发现动情间期、动情后期在0min、30min时LH水平相比有显著性差异(P=0.043、0.003＜0.05)。动情前期、动情期虽然LH水平在30min时较0min高，但与0min时相比无显著性差异(P=0.387、0.075＞0.05)。 (6)下丘脑正中隆起损毁后，针刺关元穴(CV4)前、后GnRH的水平由43.79±1.82皮克／ml变为49.98±2.46皮克／ml，两者相比无显著性差异(P=0.066＞0.05)，尽管大于0.05，但治疗后GnRH的水平还是有增高的趋势；LH的水平由46.80±1.02活性单位／ml变为47.52±1.29活性单位／ml；E2的水平由445.70±43.77皮克／ml变为445.74±34.23皮克／ml。LH和E2的水平在治疗前、后几乎没有变化。 4结论 (1)用电生理方法可以简单快捷的在活体鉴定下丘脑与性唤起相关神经元。结合HRP示踪技术及GnRH免疫组化染色结果：疑似下丘脑与性唤起相关神经元神经元就是GnRH神经元。 (2)针刺能有效调节下丘脑GnRH神经元的活性，但不同的穴位调节效应不同。在我们观察的8个穴位中，子宫(Ex-CA1)、关元(CV4)、足三里(S36)的调节作用最佳。 部位或穴位的神经节段支配与生殖器官的神经节段支配越接近，对下丘脑GnRH神经元的调节作用越明显。针刺在雌激素水平较低的动情间期和动情后期对下丘脑GnRH神经元电活动增加的百分率能达到或超过雌激素水平较高的动情前期和动情期。 (3)“卵巢炎症”在体表的敏感穴区所属的脊髓神经节段与支配卵巢功能的脊髓神经节段相一致。敏感穴区对应的穴位正是特异激活下丘脑GnRH神经元的穴位。 (4)电针后下丘脑GnRH免疫反应表达明显增加的部位有：内侧视前区、弓状核、室旁核及隔区、杏仁核等部位。这些核团是调节生殖内分泌功能的关键部位。针刺能调节生殖内分泌功能或许是通过促进这些核团的GnRH免疫反应表达实现的。 能使下丘脑GnRH神经元电活动特异性增强的穴位也是能够特异增强GnRH免疫反应表达的穴位，针刺后动情间期及动情后期GnRH免疫反应表达增加的百分率高于动情前期和动情期。 (5)GnRH为微量物质，但能控制LH、E2的分泌并表现出同步性。同一穴位在动情周期不同阶段对外周血GnRH和LH水平的调节效应不同，以动情间期和动情后期表现更明显；不同穴位在动情周期相同阶段对外周血GnRH和LH水平的调节效应不同，能使下丘脑分泌GnRH神经元电活动特异性增强的穴位也是促进外周血GnRH和LH水平增高的有效穴位。 针刺对生殖内分泌功能的调节主要是促进下丘脑GnRH的分泌，通过HPGA调节LH、E2外周血的水平。

【关键词】：针刺 细胞外记录 下丘脑GnRH神经元 动情周期 GnRH免疫反应的表达 放射免疫检测 下丘脑-腺垂体-性腺轴
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R245
【目录】：