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《中国中医科学院》 2007年
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海蛇乙醇提取物对胶原诱导关节炎大鼠滑膜血管生成调控因子的影响

任海霞  
【摘要】: 目的 本实验采用DA大鼠胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis,CIA)模型,从类风湿性关节炎滑膜新生血管生成的角度,部分揭示海蛇治疗类风湿性关节炎的作用机制,并为中医运用虫类药通络治疗痹证提供科学依据。 方法 1动物分组及处理 将30只雄性DA大鼠随机分为3组:空白对照组、CIA模型组、海蛇治疗组,每组10只。参照文献,于实验开始第一天,取适量大鼠Ⅱ型胶原,将其溶于0.1M乙酸,配成浓度为2mg/mlⅡ型胶原溶液,此溶液再与等量完全Freund's佐剂(CFA)混合,充分乳化后,按150μgⅡ型胶原/只大鼠,于尾根部皮下注射,空白对照组以等量生理盐水于尾根部皮下注射。造模第15d,海蛇组按1.84g/kg·d,1ml/100g体重灌胃给药,空白对照组及模型组分别按1ml/100g体重给予生理盐水灌胃,治疗后30d乙醚麻醉下取全血;处死动物,取膝关节用多聚甲醛固定36h后,放入10%EDTA·Na_2溶液脱钙备用。 2指标检测 2.1关节炎指数(Arthritis Index,AI)的计算 造模后第15d开始观察并记录全身关节病变程度。根据《现代药理实验方法》一书中的方法,关节积分每周两次,以判断其大体发病率。全身病变按5级评分法评价,4只肢体的病变程度累计积分,计算出AI。0分:无红肿;1分:小趾关节红肿;2分:趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来,即为每只大鼠的AI,每个动物最大为16分。 2.2大鼠膝关节光镜观察 取大鼠的膝关节用多聚甲醛固定,10%EDTA·Na_2溶液脱钙,酒精逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,常规HE染色。光镜下观察滑膜、软骨、骨的病理改变。 2.3外周全血T细胞亚群检测 样品测定管中各加入50μl抗凝血,然后每管中加入相应的抗体10μl,振荡混匀,4℃冰箱避光孵育30min,加入1ml 0.84%NH_4Cl溶血素,振荡混匀,室温避光放置5min,1200r/min离心3min弃上清液,加入PBS 1ml,1200r/min离心3min弃上清液(PBS共洗涤两次),加入PBS400μ1,混匀后上机检测。 2.4外周血TNF-α、IFN-γ细胞因子及抗CⅡ抗体含量检测 外周血TNF-α、IFN-γ含量检测,具体流程如下:一抗包被塑料板4℃过夜;将包被有特异抗体的塑料板洗1次;向凹孔内加250μl Assay Buffer封闭,室温(20~25℃)反应2h;洗板2次;加50μl样品稀释液和50μl检测样本(标准孔内加入标准品);加50μl生物素标记的第Ⅱ抗体,室温2h;洗板4次;加100μl链亲合素标记的辣根过氧化物酶,室温1h;洗板3次;加100μl TMB,避光,室温20~30min;加100μl终止液;读板(450nm)。 外周血抗CⅡ抗体含量检测,具体流程如下:用10μg/ml小牛关节软骨CⅡ包被塑料板4℃过夜,每孔50μl,含CⅡ0.5μg;洗板1次;向凹孔内加100μl1%BSA-PBS封闭,室温1h;洗板2次;加100μl稀释样品血清(标准孔内加入标准品),室温2h;加50μl生物素化山羊抗大鼠抗体,室温1h;洗板4次;加100μl链亲合素标记的辣根过氧化物酶,室温30min;洗板3次;加100μl TMB,避光,室温15min;加100μl终止液;读板(450nm)。 2.5大鼠膝关节滑膜VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ阳性细胞检测 取大鼠的膝关节多聚甲醛固定,10%EDTA·Na_2溶液脱钙,酒精逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,进行VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ的免疫组化检测。 PV-6001染色法:脱蜡、水化组织切片;3%H_2O_2孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性;蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min;石蜡切片胰蛋白酶抗原修复;滴加10%正常血清封闭非特异性抗原孵育20min;倾去血清;分别加入相应一抗体,4℃过夜(以PBS代替一抗作阴性对照);PBS冲洗5min×3次,滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体,37℃孵育30min,PBS冲洗5min×3次;DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片;干燥后观察结果。每张切片随机选取6个视野拍照,计算每个视野中阳性表达面积的百分比值,累计相加后取平均值即为此张染色片的阳性表达面积的百分比值。 2.6统计学分析 实验结果用均数±标准差((?)±s)表示,数据经方差齐性检验确定方差齐同后采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验。 结果 1大鼠AI变化:从第24d开始CIA模型组AI明显高于海蛇治疗组,统计学差异显著,且从第24d到第45d海蛇治疗组AI逐渐降低。结果表明海蛇乙醇提取物治疗效果明显。 2 HE染色光镜观察结果:CIA组大鼠膝关节光镜观察可见滑膜细胞增生明显,滑膜组织充血水肿,毛细血管增生,血管内膜变形增生,管腔变窄或阻塞,血管翳形成,关节软骨退行性变,关节面破坏,并可见炎细胞浸润。海蛇乙醇提取物治疗后增生的滑膜组织内的炎细胞、滑膜细胞及毛细血管数量减少,滑膜增生及滑膜组织水肿明显减轻,新生血管显著减少,血管内膜增厚减轻,少见血管翳形成,关节面破坏减轻。 3外周血T细胞亚群的检测结果:在免疫后45d,CIA组CD4、CD8与空白对照组相比均明显升高;海蛇组与CIA组相比,CD4、CD8明显下降,尤其是CD4显著降低(P<0.01),海蛇组与空白对照组相比较无显著性差异。 4血清中抗CⅡ抗体含量的检测结果:CIA组抗CⅡ抗体含量显著升高,表明CⅡ可能是RA致病的潜在抗原。海蛇治疗组抗Ⅱ型胶原抗体含量较CIA组明显降低,表明海蛇组关节损伤较CIA组明显减轻,释放的Ⅱ型胶原减少。 5血清中TNF-α、IFN-γ含量的检测结果:CIA组血清中TNF-α含量较空白对照组显著升高,TNF-α是一种主要的炎性因子,与VEGF的表达呈正相关,促进滑膜血管增生,在RA的发病中起重要作用。海蛇治疗组TNF-α含量较CIA组明显降低,统计学差异显著,表明海蛇可通过多环节抑制新生血管生成。CIA组IFN-γ含量较空白对照组明显升高,表明CIA主要表现为Th1型器官特异性的自身免疫病。海蛇乙醇提取物可通过调节免疫系统,显著降低IFN-γ的表达,从而阻断了由IFN-γ大量分泌形成的恶性循环。海蛇治疗组IFN-γ含量明显低于CIA组,统计学差异显著。 6大鼠膝关节滑膜VEGF、Flk-1、Flt-4、Ang-2、Tie-2、TNF-α、IFN-γ阳性细胞检测结果:CIA组VEGF、flk-1、flt-4增高的同时,Ang-2、Tie-2表达亦增高,与空白对照组相比差异显著,表明VEGF与Ang-2协同作用促进新生血管生成。CIA组TNF-α、IFN-γ的阳性表达较空白对照组明显升高,TNF-α与VEGF的表达呈正相关关系。海蛇治疗组大鼠膝关节滑膜VEGF及其受体Flk-1、Flt-4的表达与Ang-2、Tie-2的表达均明显降低,且TNF-α、IFN-γ的表达显著降低,与CIA组相比统计学差异显著。 结论 海蛇治疗类风湿性关节炎的功效与抑制RA新生血管生成相关,海蛇乙醇提取物不仅可直接抑制VEGF/VEGFR通路和Ang-2/Tie-2的表达发挥抑制滑膜新生血管生成的功效,还可通过调节免疫系统,降低IFN-γ、TNF-α等炎性因子的分泌而间接抑制滑膜新生血管生成。
【学位授予单位】:中国中医科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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