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《中国食品药品检定研究院》 2015年
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应用人胚胎干细胞分化的心肌细胞进行心脏毒性评价方法的研究

张真真  
【摘要】:研究背景与目的药物引发的心脏毒性一直是药物研发人员以及各国药监部门关注的重点。人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)、FDA、CFDA等相继颁布了多项规定和条例来加强药物的心脏毒性评价研究。现有的心脏毒性评价缺乏有效、合理的实验模型,建立准确可靠的方法评价药物的心脏毒性在药物早期研发阶段具有重要的意义,是当前药物安全性评价及毒理学研究亟需解决的问题。近年来,有关人胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞(Human Embryonic Stem Cell-derived Cardiomyocytes,h ESC-CM)的研究日益增多,研究指出其可成为一种用于评价药物心脏毒性的新型模型。因此我们选用几种不同毒性机制的阳性药物研究h ESC-CM心脏毒性评价方法,从细胞的功能和电生理变化两个方面综合评价药物的心脏毒性,并应用细胞功能评价方法评价化合物A的心脏毒性。研究方法与结果1.应用人胚胎干细胞分化的心肌细胞进行细胞功能评价的研究本研究选用不同种类的心脏毒性药物:阿霉素(蒽环类抗肿瘤药,Doxorubicin,DOX)、伊马替尼(酪氨酸激酶抑制剂,Imatinib,IMA)、异丙肾上腺素(β受体激动剂,Isoproterenol,ISO)、维拉帕米(钙离子通道阻滞剂,Verapamil,VER),分别与成熟分化、状态稳定的h ESC-CM孵育,采用实时细胞分析法和高内涵荧光成像技术检测心肌细胞搏动的振幅、频率、规则性及线粒体膜电位等指标在给药1 h、4 h、24 h、48 h、72 h、96 h后的变化,建立人胚胎干细胞分化的心肌细胞心脏细胞功能毒性评价方法。在以上研究基础上,应用此方法评价化合物A的心脏毒性。实验结果显示:①各浓度组的阿霉素作用于h ESC-CM时,细胞的搏动振幅、搏动频率、搏动规则指数、线粒体膜电位均降低,对心肌细胞具有明显的毒性作用;②20μmol·L-1的伊马替尼抑制细胞的搏动振幅、搏动频率、搏动规则指数、线粒体膜电位,说明高浓度的伊马替尼毒性作用明显;③异丙肾上腺素使h ESC-CM的搏动振幅降低、搏动频率升高,但此作用具可逆性,药物的浓度越小可逆性越强,异丙肾上腺素对细胞的搏动规则指数、线粒体膜电位无明显影响;④维拉帕米使h ESC-CM的搏动振幅、搏动频率迅速降低,该作用在药物低浓度时可得到缓解,细胞的搏动规则指数、线粒体膜电位均无明显变化。在方法的应用阶段,化合物A和其阳性对照药托法替布对h ESC-CM的影响一致:对搏动振幅的抑制作用成浓度时间相关性;对搏动频率、搏动频率规则指数也有一定的抑制作用;对线粒体膜电位的影响不显著。2.应用人胚胎干细胞分化的心肌细胞进行心脏电生理功能评价的研究研究选用DOX、IMA、ISO、VER分别与h ESC-CM孵育,应用标准的全细胞膜片钳技术记录各实验组心肌细胞动作电位、h ERG钾电流、Nav1.5电流、以及L-Ca2+电流在给药前后的变化,建立人胚胎干细胞分化的心肌细胞心脏电生理功能评价模型。结果显示:①DOX对h ESC-CM动作电位时程(Action Potential Duration,APD)有轻微的缩短作用,减小动作电位振幅(Action Potential Amplitude,APA)、降低静息电位(Resting Potential,RP),以上作用随DOX浓度的增加而增强;DOX对动作电位0相除极速率(Max dv/dt)、Nav1.5电流、L-Ca2+电流及h ERG电流无明显作用;②IMA对h ESC-CM的Nav1.5电流有强烈的抑制作用,IC50低至2.00±0.49μmol·L-1;对L-Ca2+电流具有抑制作用,IC50为23.4±9.8μmol·L-1;对h ERG电流无明显作用;细胞的APA、APD50、APD90随IMA浓度增加而缩短,提示IMA可缩短细胞动作电位时程,分析该作用可能与它对Nav1.5、L-Ca2+的抑制作用有关;③ISO对h ESC-CM的Nav1.5电流抑制作用较小,IC50大于100μmol·L-1;但对L-Ca2+电流具有激活作用,可增强L-Ca2+电流,除此之外,ISO还可抑制h ERG电流;ISO对细胞的动作电位无明显作用;④VER对Nav1.5电流有抑制作用,IC50为47.3±5.4μmol·L-1;对L-Ca2+电流有强烈的抑制作用,使其迅速降低,IC50为7.1±1.5μmol·L-1;对h ERG电流有明显的抑制作用,IC50为3.5±1.0μmol·L-1;APD50、APD90、APA、RP以及动作电位Max dv/d随VER浓度的增加而受到VER的抑制;以上结果提示VER具有多离子通道抑制作用,明显影响h ESC-CM的电生理功能。结论本研究分别建立了应用人胚胎干细胞分化的心肌细胞进行细胞功能和电生理功能评价的方法。应用结合实时细胞分析法以及高内涵细胞成像技术建立的心脏细胞功能评价方法成功评价了新化合物的心脏毒性。结果说明人胚胎干细胞分化的心肌细胞可作为一种新的实验模型,用于评价药物的心脏毒性。
【学位授予单位】:中国食品药品检定研究院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R96

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