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《中国食品药品检定研究院》 2015年
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hBcl-xl稳定过表达有效支持丁酸钠提高CHO-K1细胞内重组蛋白表达水平

刘娜  
【摘要】:重组蛋白是目前生物医药产业中发展最为迅速的一类医药产品。重组蛋白的生产主要依赖于大肠杆菌、酵母菌和哺乳类细胞。哺乳类细胞中的CHO细胞,因其可保证外源蛋白有效折叠、组装和翻译后修饰,又易于悬浮培养,可确保外源蛋白高表达水平和稳定的生物学活性,因此更适于产业化发展。但是CHO细胞在提高重组蛋白产量方面仍有诸多瓶颈因素,例如在长期培养过程中所发生的细胞凋亡。因此,理论上从突破各种瓶颈因素,如增强细胞对凋亡的抗性,应具有提高CHO细胞重组蛋白产量的可能性。本研究即利用细胞工程技术改造CHO细胞,提高其抗凋亡能力,从而提高CHO细胞重组蛋白的产量。本研究所采用的细胞工程技术策略主要是在CHO-K1细胞中稳定过表达人Bcl-xl基因,以提高细胞的抗凋亡功能。Bcl-xl是Bcl-2家族蛋白中最为关键的抗凋亡蛋白,可通过多个分子机制调节细胞凋亡。首先,利用基因转染技术,我们建立了稳定整合和高表达人Bcl-xl基因的CHO-h Bcl-xl细胞株,进一步分别检测了人源Bcl-xl基因对提高宿主细胞对物理性凋亡诱导剂(UV)和化学凋亡诱导剂(mitomycin C)的抗凋亡能力。随后,在CHO-h Bcl-xl细胞基础上,我们又转入了EGFP基因,并建立了h Bcl-xl/EGFP细胞,作为评价稳定过表达h Bcl-xl基因对重组蛋白表达稳定性及结构稳定性影响的模型细胞。整个评价内容包括在正常贴壁生长、悬浮驯化、悬浮驯化后生长及细胞库建立、丁酸钠处理等各个生产工艺关键环节中,在凋亡或非凋亡因素存在的情况下,对模型细胞中EGFP的表达及结构稳定性的变化进行分析。结果发现,h Bcl-xl稳定过表达,可使宿主细胞在任何工艺阶段,对物理(UV照射)、化学(mitomycin C)凋亡诱导剂均表现出显著的抗凋亡能力。更为重要的是,无论是否有凋亡诱导剂的存在,h Bcl-xl稳定过表达均可显著稳定EGFP的表达水平及结构完整性,尤其是可显著地支持Na Bu提高CHO细胞表达EGFP的效应,因此在提供抗凋亡功能的基础上,有效地保障了Na Bu提高CHO细胞重组蛋白产量及稳定性的功能。其中,h Bcl-xl稳定过表达对保障Na Bu提高悬浮生长的细胞中EGFP表达水平及结构稳定性的效果最为显著。与未经h Bcl-xl基因转染和未经Na Bu处理的细胞相比,改造后的细胞中具有结构稳定性的综合EGFP表达量的相对值可高达27倍多。本研究通过探索h Bcl-xl过表达对细胞凋亡抗性、重组蛋白表达的影响,初步得出结论,h Bcl-xl稳定过表达可显著提高CHO细胞对多种形式凋亡的抗性,并可保障外源重组蛋白的表达,尤其是可有效支持Na Bu提高CHO细胞重组蛋白的表达水平及结构的稳定性。
【学位授予单位】:中国食品药品检定研究院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q813;Q78

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