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《中国药品生物制品检定所》 2005年
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猪源性医疗器械中猪内源性逆转录病毒的检测方法研究及白蛋白生物胶的研制

付海洋  
【摘要】:本课题分为两部分。第一部分的目的是设计实时荧光PCR实验检测猪源性医疗器械中猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)RNA。PERV是普遍存在于猪体内的一种内源性的逆转录病毒,目前虽然没有感染人类的证据,但是体外试验表明它能够感染某些人类细胞株,具有一定的潜在危害。首先,本实验用DNASTAR软件进行序列比对,确定保守区域的位置,并在此区域内设计一对普通PCR引物、一对实时荧光PCR引物和探针。PERV是内源性逆转录病毒,猪的基因组内普遍存在多个PERV前病毒的拷贝,通过普通PCR反应从猪肾细胞PK15的基因组扩增目的片断,将该目的片断与T载体连接,转化到大肠杆菌感受态细胞JM109中,通过蓝白斑筛选阳性克隆,体外转录获得标准品RNA,制备标准曲线。结果显示该检测体系最低检测限为每个反应1000个病毒RNA拷贝,当病毒拷贝数在10~3-10~7范围内具有很好的线性。本课题还用该体系对6个样品进行了检测,结果全部为阳性。同时样品逆转录酶活性的检测结果也为阳性。以上结果说明实时荧光PCR法具有灵敏度高,特异性好,重复性好等优点,适合用于猪源性医疗器械中病毒RNA的检测,可以广泛应用于此类医疗器械的病毒安全性评价。本实验所检测的几种猪源性医疗器械中均含有PERV,由于这些产品与人体组织直接接触,因此具有一定的潜在危险。 第二部分的目的是研制一种医用生物胶。该生物胶的主要成分是白蛋白,本实验应用W.Schneider发明的经典热乙醇法从猪血清中提纯白蛋白,原理如下:辛酸钠是一种白蛋白稳定剂和热保护剂,在加热的条件下,它能保护白蛋白,并保持其原有的生物活性,对热不稳定的其它蛋白因发生了不可逆的变性而被沉淀。该方法简单,成本低,提取的白蛋白完全能满足制备生物胶的要求。在研究生物胶最优配方时采用正交设计探索最大剪切力,结合细胞毒性研究结果,获得剪切力较大、细胞毒性较小的最优配方。
【学位授予单位】:中国药品生物制品检定所
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TH77

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