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《国家海洋局第三海洋研究所》 2011年
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大黄鱼组织蛋白酶B、L、S的分子克隆和半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatins的初步功能研究

杨志军  
【摘要】:Cathepsin是一类溶酶体类半胱氨酸蛋白酶,而cystatin是一类与半胱氨酸蛋白酶紧密结合的、可逆的天然抑制剂。它们都存在于所有的生物体内,通过cystatin对cathepsin的调节,参与多种生物学、病理学过程。在我们的前期研究中,建立了一个嗜水气单胞菌诱导的大黄鱼脾脏的转录组文库,从中发现了一些cathepsin序列和cystatin序列,经测序比对后确定为大黄鱼cathepsin B、L、S和cystatin B、F和一个新型的cystatin。 本文首先克隆了cathepsin B、L和S的cDNA序列,分析表明它们ORF分别为993bp、1011bp和1014bp,分别编码330、336和337个氨基酸的蛋白。然后在毕赤酵母中表达并纯化cathepsin B、L、S,测定它们对底物Z-FR-AMC的Km值分别为40.68μM、9.78μM和52.49μM。 本文克隆了1个cystatin B全长cDNA,它全长590bp,编码一个98个氨基酸的蛋白,分子量11KD。分别与鱼类和哺乳动物有50.51%-63.27%、43.93%-48.98%的序列同源性,与日本牙鲆同源性最高。它有典型的Gly(4)、QVVAG(46-50)的cystatin家族保守结构域。基因组结构分析表明,大黄鱼cystatin B基因组由3个外显子和2个内含子组成,与人、鼠和斑马鱼cystatin B的基因组结构基本一致。RT-PCR分析表明该基因在血、肝、肠、脾、肾、心、鳃和肌中为组成型表达,在肾中基因转录水平最高,在鳃中最低。分别用三联灭活细菌疫苗和poly(I:C)刺激后,该基因的mRNA水平在肾、脾中上调。用pET-His原核表达载体表达大黄鱼cystatin B基因,纯化了重组Lyccystatin B蛋白。检测了该蛋白对papain、legumain、cathepsin B、L、S的抑制活性,它对papain、cathepsin L、S有抑制活性,其抑制常数分别为1.01×10~(-9)M、1.82×10~(-11)M、4.84×10~(-12)M,对legumain和cathepsin B没有抑制活性。 本文还克隆了1个大黄鱼cystatin全长cDNA,它全长925bp,编码一个147个氨基酸的蛋白,其分子量大约为17KD,推测它有18个氨基酸组成的信号肽序列。它分别与鱼类有和哺乳动物cystatin C有14%-17.33%、14.94%-26.88%的序列同源性,而且与本实验以前发现的一个cystatin的同源性也只有16.33%。大黄鱼cystatin具有典型的Gly(35)、QVTNV(79-83)、PR(125-126)的cystatin家族保守结构域,在C端有4个保守的半胱氨酸形成2对二硫键以维持其空间结构。但是在其他物种中cystatin中间保守结构域为QxVxG或QxxxG,而大黄鱼的cystatin保守结构域为QVTNV,几乎完全不一样,这可能影响其活性。序列中有一个N糖基化识别位点。各物种cystatin(包括cystatin C、M、F)做成的进化树分析,该cystatin独立成为一支,与cystatin C、M、F都不在一起。基因组结构分析,大黄鱼cystatin基因组由3个外显子和2个内含子组成,与人、鼠、斑马鱼cystatin C基因组结构基本一致。但是其他物种外显子长度几乎一样,而大黄鱼cystatin的外显子明显不一样,还有其内含子也比其他的物种要小的多,而且在其他物种中第一个内含子比第二个内含子要大,而该基因的第一个内含子比第二个内含子要小,与之相反。由这些数据推测其可能是一个新的cystatin。RT-PCR分析表明该基因在血、肝、肠、脾、肾、心、鳃和肌中为组成型表达,在肠中基因转录水平最高,在鳃中最低。分别用三联灭活细菌疫苗和poly(I:C)刺激后,该基因的mRNA水平在肾、脾中上调。用pPICZαA表达载体在毕赤酵母中表达了大黄鱼cystatin基因,并纯化了重组Lyccystatin蛋白,发现它具有一个糖基化位点,可能为糖蛋白。检测了该蛋白对papain、legumain、cathepsin B、L、S的抑制活性,它对papain、cathepsin L、S有抑制活性,其抑制常数分别为2.90×10~(-8)M、1.81×10~(11)M、2.02×10~(11)M,对legumain和cathepsin B没有抑制活性。 同时,本文克隆了一个大黄鱼cystatin F全长cDNA,它全长935bp,编码一个144个氨基酸的蛋白,其分子量大约为16KD,推测其有一个26个氨基酸的组成的信号肽序列。它分别与鱼类有和哺乳动物cystatin F有40.69%-43.84%、28.57%-36.73%的序列同源性,其中与白斑狗鱼的同源性最高为43.84%,与人和小鼠cystatin F有28.57%和29.76%序列同源性。大黄鱼cystatin F含有典型的cystatin家族结构域Gl(y35)、QVVRG(79-83)、PW(90~-91)。4个半胱氨酸,分别是C~(97)、C~(108)、C~(122)、C~(142)可能形成两对二硫键,维持其独特的空间结构。另外,大黄鱼的cystatin F氨基酸序列中含有S106N107残基,可能是抑制legumain的活性位点。此外,其氨基酸序列中含有5个N糖基化识别序列。RT-PCR分析表明该基因在血、肝、肠、脾、肾、心、肌中表达,在肾中基因转录水平最高,在鳃中无表达。分别用三联灭活细菌疫苗和poly(I:C)刺激后,该基因的mRNA水平在肾、脾中上调。用pPICZαA表达载体在毕赤酵母中表达了大黄鱼cystatin F基因,并纯化了重组Lyccystatin F蛋白,判断它具有二个糖基化位点,可能为糖蛋白。检测了该蛋白对papain、legumain、cathepsin B、L、S的抑制活性,其抑制常数分别为1.42×10~(-8)M、1.32×10~(-9)M、2.34×10~(-8)M、1.64×10~(11)M、9.39×10~(11)M。
【学位授予单位】:国家海洋局第三海洋研究所
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S917.4

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