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《国家海洋局第三海洋研究所》 2009年
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南极深海沉积物中微生物低温脂肪酶的筛选和基因克隆表达

杨宁  
【摘要】: 从南极深海沉积物中筛选到一产脂肪酶的菌株Lip001,细胞呈短杆状,单个排列,无鞭毛,大小为0.5~0.8μm×1~1.5μm,为革兰氏阴性菌;生长温度范围在5~30℃(最适生长温度为10~20℃),生长pH范围在4~10之间(最适生长pH值为6~8),生长盐度范围在0~8%之间(最适生长盐度为范围为1~4%)。菌株Lip001能够分解多种单一碳源并产生脂肪酶,最适产酶温度、时间和pH值分别为20℃下、24小时和pH6~8。粗酶液经硫酸铵盐析、Q Sepharose XL柱层析、Sephadex G-75凝胶过滤后,获得了单一条带的电泳纯酶,其分子量大小为55kDa,并对纯化后的蛋白酶进行酶学性质的研究。该脂肪酶的最适反应pH值为9~10,最适反应温度为35℃,是典型的低温碱性脂肪酶,对热敏感。高浓度的变性剂和EDTA都能抑制该脂肪酶,且金属离子对酶活性中心构象有关键性的影响。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)对该脂肪酶有较为明显的激活作用,而Cd~(2+)、Co~(2+)和Zn~(2+)则能抑制酶活。通过构建Lip001基因组DNA的Fosmid文库,获得一段编码羧酸酯酶的基因,氨基酸序列分析其属于脂肪酶超级家族中的一员。 从南极深海沉积物中筛选到一产脂肪酶的菌株Lip004,利用普通PCR和染色体步移的方法获得了脂肪酶基因lipA,构建重组表达载体,在大肠杆菌中获得表达,表达后的重组蛋白也得到了纯化。该研究结果及其所建立的技术为南极丰富的低温酶资源的研究开发奠定了基础。 提取西太平洋“暖池”区深海沉积物样品总DNA,利用异化型亚硫酸盐还原酶(DSR)和甲基辅酶M还原酶(MCR)基因的简并引物,采用PCR-RFLP方法对沉积物样品中这两类功能基因多样性进行研究。该沉积物中的dsrAB基因分别来源于δ-变形菌中的6个属,其中最多的是脱硫弧菌属和脱硫杆状菌属;mcrA基因均来源于产甲烷古菌,其中主要是甲烷微菌。这些基因在系统发育树上都处于相对独立的分支。此外,还有较多的dsrAB,mcrA基因来源于未知的新属或新种。这些结果表明该海区沉积物中由微生物参与的硫和甲烷循环比较活跃,而且其中可能存在多种新的代谢途径。 本论文是在国家高技术研究发展计划(863计划,2007AA091407)和中国大洋协会项目(DYXM-115-02-2-04)资助下完成的。
【学位授予单位】:国家海洋局第三海洋研究所
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q936

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【参考文献】
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