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《上海医药工业研究院》 2000年 博士论文
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蟾毒灵脂质体的研究

梁伟  
【摘要】: 蟾酥在我国已有上千年的应用历史。最近研究发现,蟾酥主要成分之一蟾毒灵 (bufalin简称BF)具有选择性地诱导人白血病细胞分化和凋亡的作用,并可恢复临 床上耐维甲酸白血病细胞对维甲酸的敏感性,与其它抗肿瘤药合用,可提高肿瘤细 胞对抗肿瘤药物的敏感性。但蟾毒灵具有很强的强心作用,剂量小,治疗指数窄, 影响了它的使用。本文旨在将蟾毒灵制成脂质体(Liposome,L),利用脂质体具有 靶向和降低毒性的特点,探索将蟾毒灵用于抗肿瘤的可能性。 蟾毒灵系采用硅胶G柱层析法从蟾酥氯仿提取物中分离而得,并经~(13)C-NMR和 ~1H-NMR进行了结构确证。 采用薄膜法分别制备了蟾毒灵阳离子、阴离子及中性脂质体。发现于磷脂中加 入改变脂膜电性的其他成分对蟾毒灵的包封率、渗漏及脂质体的粒径无明显影响。 DSC研究表明,胆固醇(Chol)、十八胺(OA)、二硬脂酰磷酸甘油(DSPG) 及BF均使磷脂酰胆碱(phosphocholine,PC)脂膜主相转变温度变宽,向低温方向移 动。~(31)P-NMR谱图表明,未经超声波处理的PC脂膜,BF可降低PC脂膜的流动性, 呈凝胶相特征。PC双分子层膜经超声波处理后可形成脂肪链由内向外翻转的单层小 囊泡,呈六晶相特征。BF可加速上述过程,可能是由于BF的存在减弱了PC分子 间的作用力,从而使PC脂膜更易受外力作用的影响。固体~(13)C-NMR谱解析表明, BF与PC可产生较强的相互作用。25℃时BF可使PC分子中甘油骨架碳原子及胆碱 与磷原子相连的两个碳原子核磁共振峰消失,BF也使PC脂肪链远离羧基端的3个 碳原子以及近羧基端的3个碳原子核磁共振峰发生明显的强度变化,影响碳链的转 动。上述实验结果说明BF可能插入到PC双分子层脂膜中,超声波处理改变了PC 脂膜的结构。 PC-BF-Chol-L、PC-BF-OA-L、PC-BF-DSPG-L三种荷电性不同的蟾毒灵脂质体 及BF对HL-60细胞生长抑制的IC_(50)分别为2.5×10~(-8)M、1.6×10~(-8)M、2.0×10~(-8)M、 2.O×10~(-8)M。BF浓度为1×10~(-7)M时三种脂质体及BF可完全抑制HL-60、U937细胞的 生长,而1×10~(-8)M BF对HL-60、U937细胞的生长抑制率分别为17.2%和18.6%。表 明PC-BF-OA-L对HL-60细胞生长的抑制作用最强,PC-BF-DSPG-L次之, PC-BF-Chol-L较差。蟾毒灵产生细胞毒作用的浓度范围很窄在1×10~(-7)~1×10~(-8)M。 妇毒灵脂质体的研究 IIL-60细胞经PC-BF-Chol-L、PC-BF-OA-L、PC.BF-DSPG-二及BF以不同浓度 处J‘ill 24小f 以及厂 IX10“*M BF处理不同lj问,PC.BFChol.L、PC-BFOA1 @导 HL60细胞凋亡的效果较PC-BFDSPG*与BF稍弱。细胞周期分析表明,三利:脂质 体和 BF均使 HL60细胞阻止在 G。-M期。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示,浓度为 IX10”‘M的 BF和 BF三种月质体处理 HL-60自0 15刁时·以及 l。10刁M向 BF f[IBF 三刊。脂质体处理HL-60纫胞24小时,HL-60细胞DNA呈现明显的梯状条带门adder), 为凋亡细胞*NA的典型特征。提示蜡毒灵对H卜6O细胞生长的抑制仆J!I足其血过沥 导细胞程序化死亡(即凋亡)来实现的。 HL-60细她经卜 10{M禾 IXIO”gM的 PC-BF-DSPG-L与 BF处理 3天,通过 NBT 还原能力的测定,计算分化细胞的百分数。结果表明,lx10“gM的 l。C.BF.DSPG.L 与 BF诱导 HL-60细胞分化的百分数分别为 sl.60和 78.3O,IX10-‘M BF没有进一步 提高HL-60细胞分化的百分数。 小鼠腹腔单次注射赡毒灵及赡毒灵脂质体,其LDS。值分别为1石4O.5叫.8)sg从g *2*8(Z.43~Z.95)<**,两者相差1*3倍,具有显著性差异(P<0*1)。赡毒灵 O*3。ng/吨及峭毒灵脂质体口.5*mg/g0等毒齐迢对小鼠*训s月癌(皮下栓中D。〕的 抑瘤率分别为 39.130$[146.740(P<0.05),赡鸯灵脂质体优于蜡毒灵;以等剂量 0.u>旮咋相比,抑瘤率分别为39.门%和枯.84%(P>0.05)。赡毒灵脂质体可以降低 赡毒灵的毒性和提高抗肿瘤效果。


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