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《上海医药工业研究院》 2003年
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万古霉素耐药模型的建立以及抗耐药菌化合物的分离

郭长伟  
【摘要】: 万古霉素是目前临床上用于治疗革兰氏阳性菌引起的严重感染的药物,由于万古霉素的频繁使用,出现越来越多对它具有耐受性的细菌。据报导万古霉素耐药肠球菌在美国的发生率已经占肠球菌引起感染的19%,在国内也已经占4%,近些年又发现了对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌,这些菌株对人类的健康具有极大的威胁。 为了从微生物资源中寻找对万古霉素耐药肠球菌以及对万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌有效的化合物,首先要建立筛选模型。至今根据耐药机制建立了一些筛选模型,但由于细菌对一种抗生素产生的耐药性是几种不同机制综合作用的结果,因此本研究利用物理方法和基因工程方法建立针对全细胞的筛选模型。 长期的实践证明紫外线辐射诱变是在微生物育种中行之有效的方法,本文通过对紫外线诱变条件的优化,最终得到合适的诱变条件,应用此条件经过不断筛选,最终获得对万古霉素中度耐药的肠球菌458 V20和金黄色葡萄球菌9918 V16。药物敏感性试验表明458 V20对青霉素和红霉素耐药,而9918 V16对青霉素、红霉素和苯唑青霉素耐药,二者对万古霉素的耐药性在无药培养基上传代10代后略微下降。458 V20对万古霉素和替考拉宁耐药程度的差异显示它可能是VanB型VRE,菌体蛋白和细胞膜蛋白的SDS-PAGE图谱也证实了这一点。对9918 V16进行了一系列的研究,结果表明9918 V16凝固酶产生能力和菌体自溶能力均有所下降,而万古霉素和替考拉宁对9918 V16和9918的抗生素后效应显示一定的差异。 金黄色葡萄球菌原生质体制备是比较困难的问题,本文对金黄色葡萄球菌原生质体形成条件进行了探索,最后建立了一个比较高效的方法:酶解液中含20mg/ml lysozyme和0.4mg/ml lysostaphin,在37℃下作用2h,可以获得质量较好的原生质体。应用此方法从医院内获得的有致病性的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 293中分离到质粒,并将此质粒转化到无致病性的敏感金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923中,使其对泰能的敏感程度下降(从0.032mg/ml到0.5mg/ml)。 应用本工作中筛选到的耐药菌株,对从土壤中分离到放线菌的发酵液的生物活性进行了测定,在1200株土壤微生物中,有48株菌株的发酵液对检测菌株显示了较高的活性。经过不同的耐药菌株对这些发酵液进行复筛,结果表明有4株放线菌的发酵液对肠球菌和金黄色葡萄球菌等耐药的革兰氏阳性球菌显示出很高的活性,但对革兰氏阴性耐药菌无活性。 对菌株SIPI2001-542、SIPI2001-270和SIPI-2001-1140的代谢产物进行研究,应用 耐药模型的建立与抗耐药菌化合物的分离 溶媒萃取、硅胶柱分离和重结晶等方法,从其发酵液中分离出活性成分SIPI2001一542· SIPI2001一270一I、SIPI20OI一270一11和SIPI一2001一1 140一8以及SIPI一2001一1140一10。综合紫 外光谱、红外光谱、Ms图谱、’H一MR和’3c-NMR等图谱数据的解析,确定sIPI2001一542 的结构与放线菌素D一致,SIPIZO01一 270一I的结构与放线菌素C:一致,SIPI2001一270一H 的结构与放线菌素C3一致,SIPI一2001一1 140一8的结构与醒霉素A结构一致, sIPI一2001一1 1 40一10的结构与醒霉素C结构一致。生物活性研究表明,SIPIZO01一542对耐- 药革兰氏阳性‘球菌的抑制活性高于万古霉素和替考拉宁等糖肤类抗生素。 在研究中发现用于抗肿瘤的抗生素放线菌素D和醒霉素对耐药的革兰氏阳性球菌 具有很高的抑制活性,因此对其他常用的抗肿瘤抗生素的抗耐药菌活性进行比较。通过 在不同品种的培养基上,放线菌素D、丝裂霉素、博莱霉素、阿霉素、5一氟尿喀吮和依 托泊普等抗肿瘤抗生素对革兰氏阳性耐药菌的抗菌活性进行了比较,结果显示放线菌素 D和丝裂霉素在不同培养基上对458 V20以及9918 V16的MIC比万古霉素高80倍和 64倍,博莱霉素和阿霉素对敏感菌显示一定活性,但对耐药菌活性很低;5一氟尿嚓淀对 敏感菌和耐药菌都无活性;作用于细胞微管的依托泊普对试验菌株无抑制作用。
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