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《北京市结核病胸部肿瘤研究所》 2011年
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利福喷丁海藻酸钠缓释微球肺部靶向给药系统的研究

杨楠  
【摘要】:结核病特别是耐多药结核病的流行日趋严峻,肺结核已成为临床死亡率仅次于HIV的单一感染致死的传染病。自利福平问世近40年来,几乎没有新的抗结核药物出现,抗结核药物的发展明显滞后,因此着眼于现有抗结核药物剂型和给药途径的改良,已成为当前肺结核治疗的研究热点,肺部靶向给药又因其优势独特而日益受到重视。相较其他肺局部给药方式而言,支气管镜下介入给药技术成熟且较为安全,注入药物剂量准确可控,并且经气管镜可以直视患者病灶部位的引流支气管,抗结核药物可经导管直接注入病灶局部,特别是对于支气管结核、耐多药肺结核及空洞型肺结核其靶向性更强。但目前支气管镜局部注药时所选用的药物多为口服或静脉药物溶解于真溶液或混悬于凝胶中配制而成,药物的缓释效果差,有效药物浓度维持的时间较短,凝胶基质人体不能吸收,无法在局部降解,呼吸过程中肺脏不断舒缩挤压凝胶,导致凝胶注入更远端支气管和肺周边部时留滞效果欠佳。因此亟待开发一种支气管镜局部介入治疗专属的,有较好留滞性和粘附性的,并可自身降解且安全性高的缓释抗结核药物系统。本研究以海藻酸钠为药物载体,利福喷丁为模型药物,采用高压静电液滴法制备可用于支气管镜肺部介入治疗的缓释利福喷丁海藻酸钠微球,并对含药微球的表征特性、体外缓释效果、试验动物肺内应用的安全性及体内释药效果进行评价和考察。 第一部分利福喷丁海藻酸钠微球的制备 目的:制备可用于支气管镜肺部介入治疗的缓释利福喷丁海藻酸钠微球,建立高效液相色谱法测定利福喷丁含量,考察利福喷丁海藻酸钠微球制备过程中的影响因素,并对利福喷丁海藻酸钠微球制备的处方工艺进行优化。 方法:以海藻酸钠为药物载体,利福喷丁为模型药物,采用高压静电液滴法制备利福喷丁海藻酸钠微球,正交试验优化筛选处方工艺,光镜及扫描电镜观察微球形态,激光粒度仪测定微球粒径,高效液相色谱法测定利福喷丁海藻酸钠微球的包封率及载药量,并对在4℃冰箱、25℃常温、及40℃恒温培养箱内避光贮存6个月的利福喷丁海藻酸钠微球的稳定性进行考察。测试利福喷丁海藻酸钠微球能否以10ml注射器7号针头顺利吸取,及能否通过支气管镜导管打出。 结果:利福喷丁海藻酸钠微球的优化处方工艺条件:海藻酸钠质量分数为2%,利福喷丁与海藻酸钠质量比为1:1,氯化钙质量分数为2%,交联时间为2h,电压为8kv和恒流泵推进速度100ml/h。以优化处方工艺制备的利福喷丁海藻酸钠微球平均粒径为99.77μm,粒径分布基本属正态,80%以上的微球粒径在90-110μm之间,平均载药量为22.17±0.61%,平均包封率为83.06±1.31%,并具有较好的分散性及通针性,可经支气管镜管道顺畅注射。除40℃恒温培养箱储存6个月的利福喷丁海藻酸钠微球出现外周不圆整、流动性降低、粘连较多,药量及包封率下降外,其余观察条件下的微球无变化。 结论:成功制备利福喷丁海藻酸钠微球,含药微球的形态表征、载药量及包封率较为理想。 第二部分利福喷丁海藻酸钠微球的体外评价 目的:考察利福喷丁海藻酸钠微球制备过程中主要处方因素对含药微球体外释放情况的影响,及以优化处方工艺制备的利福喷丁海藻酸钠微球的体外释放效果。 方法:采用转篮法进行利福喷丁海藻酸钠微球的体外释放试验,精密称取利福喷丁海藻酸钠微球10mg,置于具塞试剂瓶中,pH7.2的磷酸盐缓冲液1000ml作为释放介质,转速100r/min,温度37±0.5℃,定时取样5.0mL,并补加同体积相应释放介质。样品经0.45μm滤膜滤过,弃初滤液,将所得续滤液用乙腈定容稀释,精密吸取20μl进样,高效液相色谱法检测药物浓度。 结果:当海藻酸钠溶液质量分数升高、利福喷丁与海藻酸钠质量比降低、氯化钙质量分数增高、交联时间的延长时,利福喷丁海藻酸钠微球的体外释药速率降低。以优化处方工艺制备的利福喷丁海藻酸钠微球的体外释放时间可达15天左右,前5d释放较快,第5d累计释放率达59.3%,5d至15d缓慢平稳释放,第15d时累计释放率为99.7%。 结论:利福喷丁海藻酸钠微球具有较好的体外缓释效果。 第三部分利福喷丁海藻酸钠微球肺内应用的安全性评价 目的:利用新西兰白兔及比格犬模型观察利福喷丁海藻酸钠微球的可溶性、渗透性以及吸收情况,对利福喷丁海藻酸钠微球肺内应用的可行性和安全性做出初步评价。 方法:将60只新西兰白兔随机分为3组,每组20只,分别为:对照组,于左肺注入生理盐水2ml。空白微球组,于左肺注入空白微球20mg加生理盐水,总体积为2ml。含药微球组,于左肺注入利福喷丁海藻酸钠微球20mg加生理盐水,总体积为2ml。将60只比格犬随机分为3组,每组20只,分别为:对照组,于左肺注入生理盐水5ml。空白微球组,于左肺注入空白微球300mg加生理盐水,总体积为5ml。含药微球组,于左肺注入利福喷丁海藻酸钠微球300mg加生理盐水,总体积为5ml。各组新西兰白兔和比格犬在进行试验操作前均测量体温、体重,试验操作后每日测量体温,观察呼吸、饮食、活动性、对外界刺激的反应、二便情况等,每周测量体重;均于注入前、注入后1d、7d、14d采集静脉血进行血常规、T细胞亚群、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量检测;注入后14d处死解剖,观察各组试验动物胸腔及腹腔脏器位置、形态、颜色是否正常,重点观察左右肺组织有无无差异,左右肺对比主支气管是否通畅,颜色是否正常,有无出血、水肿等,选取注入局部肺组织进行病理学HE染色,以免疫组化法检测肺组织中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α表达情况。此外,尚在各组比格犬中进行以下试验:以呼吸生理记录仪描记注入前至注入后60min时比格犬的呼吸频率、最大呼气峰压及最小吸气压;经支气管镜观察注入5d、10d后支气管粘膜的变化及微球留滞情况;于比格犬注入前、注入后1d、7d、14d采集动脉血进行血气分析;选取比格犬注入局部肺组织进行扫描电镜、透射电镜观察。 结果:新西兰白兔及比格犬肺内注入空白微球及利福喷丁海藻酸钠微球后,与对照组相比:均未引起窒息、咳嗽及呛咽表现,活力及进食情况无异常表现;体温、体重、红细胞数、白细胞数、血红蛋白量、单核细胞百分比、CD3、CD4、CD8百分比均无显著性差异(P0.05);处死解剖后观察胸腔及腹腔脏器形态、颜色、位置均正常,两侧主支气管均通畅,颜色正常,无出血、水肿、硬结、坏死,左右肺组织正常无差异,左肺底细支气管无空白微球存留,右肺未见有空白微球扩散进入;病理学HE染色光镜下可见支气管粘膜各层结构清晰,内膜细胞形态完整,肌层平滑肌结构清晰;肺泡结构完整,肺泡内未见细胞脱落及红细胞,肺泡间隔未见增厚;注入处局部肺组织IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α表达比较无显著性差异(P0.05)。 兔血清中细胞因子检测发现,空白微球组、含药微球组及对照组注入后1d较注入前IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量均升高,且空白微球组、含药微球组较对照组的含量要高(P0.05)。注入后7d,对照组IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量与注入前相比已无差异(P0.05),空白微球组、含药微球组IL-8、IL-10含量也恢复至注入前水平且与对照组无差异(P0.05),但空白微球组、含药微球组IL-1β、IL-6、TNF-α含量虽较注入后1d有所下降但仍比注入前高,亦高于对照组(P0.05)。注入后14d,含药微球组IL-1β、IL-6、TNF-α含量降至注入前水平且与对照组无差异(P0.05),空白微球组IL-6、TNF-α含量降至注入前水平且与对照组无差异(P0.05),但IL-1β虽较注入后7d有所下降但仍略高于注入前水平,亦略高于对照组与载药微球组(P0.05)。犬血清中细胞因子检测结果呈现出与兔检测结果大致相同的变化规律,区别在于空白微球组在注入后14d时IL-1β降至注入前水平且与对照组、含药微球组无差异。比格犬空白微球组、含药微球组与对照组的呼吸频率,最大呼气峰压、最小吸气谷压绝对值注入后即刻比较无显著性差异(P0.05);注入后15min比较有显著性差异(P0.05);注入后30min比较无显著性差异(P0.05),;恢复正常呼吸所需时间比较有显著性差异(P0.05)。比格犬空白微球、含药微球注入后5d经支气管镜观察可见,微球粘附于注入部位支气管粘膜,分散较为均匀,可见含药微球颜色变浅;空白微球、含药微球注入后10d经支气管镜观察可见,少量微球粘附于注入部位支气管粘膜,含药微球颜色基本不可见;空白微球组、含药微球组与对照组注入后5d、10d支气管镜下对比观察发现,支气管粘膜外观未见异常,无充血、水肿、硬结及坏死。比格犬空白微球组、含药微球组与对照组在注入前、注入后1d、7d、14d的动脉血pH值、动脉血氧分压、动脉血二氧化碳分压及血氧饱和度结果比较均无显著性差异(P0.05)。比格犬注入局部肺组织扫描电镜观察可见,对照组肺泡壁光滑,结构完整,间隔无增大,肺泡内无纤维渗出物,支气管粘膜纤毛排列有序,无倒伏,透射电镜观察可见,对照组肺泡上皮细胞形态结构完整,肺泡上皮细胞之间细胞连接结构完整,胞浆均匀,线粒体等细胞器无损伤,空白微球组及含药微球组与对照组比较,均未见异常。 结论:利福喷丁海藻酸钠微球肺内应用后有较好的留滞性和粘附性,并可降解吸收,不会影响试验动物的正常呼吸功能,对支气管粘膜无刺激性,不会造成肺组织病理性改变,可行性和安全性得到初步证实。 第四部分利福喷丁海藻酸钠微球体内释药研究 目的:建立利福喷丁血药浓度及肺组织中浓度的测定方法,考察福喷丁海藻酸钠微球体内药物释放情况。 方法:60只比格犬经支气管镜肺部注入300mg利福喷丁海藻酸钠微球,于肺部注药6h、12h、24h、36h、48h、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d后,各时相点随机选取5只实验动物,进行采血,留取血清。采血后处死解剖,剪取注入侧支气管局部肺组织、距注药部位1cm处肺组织,距注药部位3cm处肺组织,及对侧肺组织。采用高效液相色谱法检测血清及组织中利福喷丁药物浓度。? 结果:血清及肺组织的药物浓度大致在局部注药12h左右达到高峰分别为9.7μg/ml和24.6μg/ml。血清中药物浓度在局部注药72h后下降到0.6μg/ml,注药局部肺组织中的药物浓度则在局部注药336 h后下降到0.5μg/ml以下,注药局部1cm外肺组织中的药物浓度则在局部注药144 h后下降到0.5μg/ml,注药局部3cm外肺组织中的药物浓度则在局部注药48 h后下降到0.8μg/ml,对侧肺组织中的药物浓度则在局部注药36 h后下降到0.9μg/ml。 结论:利福喷丁海藻酸钠微球肺内应用后具有缓释作用,注药局部肺组织有效药物浓度远高于血药浓度,并可维持336 h以上。
【学位授予单位】:北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R521

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