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肺结核病灶组织与正常组织基因表达谱的差异和部分肺外结核临床分离菌株基因分型的特点

李文胜  
【摘要】:多年来的研究结果表明,在人体固有免疫系统中,巨噬细胞是针对结核分枝杆菌最重要的细胞类型。巨噬细胞与结核分枝杆菌感染的整个过程有着密切的关系,包括对于结核分枝杆菌的识别,控制以及杀灭等。近年的一些研究成果显示,在结核分枝杆菌的干扰与改造下,巨噬细胞有可能变作其逃避免疫反应的避风港,为其在人体内提供生存所需的能量和空间,甚至是为其播散提供载体。鉴于此,本课题首先选择了巨噬细胞作为研究对象,旨在通过对比肺结核病灶组织与周围正常肺组织之间巨噬细胞基因表达谱的差异,来探明在结核分枝杆菌感染肺组织的过程中,巨噬细胞里到底有哪些基因的表达受到了影响,并寻找到特异性的与肺结核发病相关的基因。此外,大多数的肺结核患者只需进行内科治疗,不会形成诸如厚壁空洞、结核球、损毁肺等需要外科手术清除的严重病灶。因此,我们拟通过本次实验寻找到与这些严重的结核病灶形成相关的基因,来初步探明这些严重结核病灶的形成机制,为开发相关手段阻止疾病的恶化提供依据。 但在对肺结核组织标本进行处理、分选其中的巨噬细胞时发现,由于每一个肺结核病人的病程、用药种类、治疗时间等等的不同,造成每一份肺组织标本之间都存在很大差异,不像使用动物模型时能够获得大致相同的病例标本。另外,由于缺少标准的使用人肺组织制备单细胞悬液的试验方法,使得我们在制备肺组织单细胞悬液时困难重重,无法通过统一的分选方法获得病灶组织与正常组织中的巨噬细胞。所以我们暂时改变实验策略,直接使用病灶组织和正常组织来进行基因表达谱的实验,这样获得的结果更能全面地反应肺组织的免疫状态。同时也可以将其中与巨噬细胞相关的数据拿出,再做深入研究。 通过对肺组织芯片结果的分析,我们发现正常组织相对病灶组织来说基因表达上调和下调2倍以上的个数分别为332个和102个,进一步增大筛选标准至4倍,则上调和下调的个数分别为19个和2个。两个表达量下调4倍的基因分别为FER1L4、PPIL5。在19个表达量上调4倍以上的基因中,AREG基因的差异表达倍数更大,在三组平行实验中均达到了11倍以上。另外,细胞因子TNF和肺结核病灶内肉芽肿的形成和解散有关,因此我们将差异表达基因内与TNF相关的一些数据单独拿出,发现有4个基因表达量在正常组织内明显上调。因此,我们认为以上这些基因,尤其是PPIL5,AREG以及TNF,由于受到结核分枝杆菌的影响,表达量发生了变化,从而导致肺组织内严重结核病灶的形成。 此外,我们还比较了肺结核手术病人在手术前后,外周血单个核细胞(PBMC)基因表达谱的差异。我们使用密度梯度离心的方法,将肺结核病人手术前后血标本中的单个核细胞分离出来,继而进行表达谱实验。通过本实验,我们想初步了解在手术去除结核病灶,也即去除绝大部分结核分枝杆菌负荷后,机体的免疫反应到底发生了哪些变化。实验结果显示,术后PBMC中有38种基因上调表达2倍以上,91中基因下调表达2倍以上。当我们将筛选标准扩大到4倍时,则找不到符合标准的基因。因此,我们又将筛选标准定在两者之间(3倍),结果显示有6中基因下调表达,2种基因上调表达。我们对这些差异表达基因进行功能检验后发现,他们与针对结核分枝杆菌的免疫反应并无明显联系。这样的结果使我们认为以外周血细胞为代表的全身免疫反应在应对结核分枝杆菌时可能不会起到关键性的作用。 我们还对小样本量的肺外结核(骨结核)临床分离菌株基因分型的特点进行了初步研究,以了解肺外结核与肺结核的致病菌在基因分型方面的差异,为探讨肺结核与肺外结核之间的关系积累数据,并为临床针对肺结核与肺外结核的差异化治疗提供相关依据。 我们利用间隔区寡核苷酸(Spoligotyping)分型法和数目可变串联重复序列分析(VNTR)分型法分别对肺结核与肺外结核的临床分离菌株进行分型,并与国际通行的结核分枝杆菌分型数据库进行对比,从而确定每株结核分枝杆菌的基因型。Spoligotyping分型结果显示,在14株肺结核临床分离菌株中有9株为Beijing基因型,2株为T2基因型,另外3株分别为MANU2型、Haaslem3型以及未命名型(结果可表示为:777777001760771)。14株肺外结核临床分离菌株Spoligotyping分型结果则高度一致,均可表示为777777777777771,为未命名型。VNTR实验得出了类似的结论,12个VNTR位点可将14株肺结核临床分离菌株完全区别开来,形成完全不同的14个基因型,而肺外结核临床分离菌株每个位点的扩增产物大小都完全相同,具有100%的成簇率。 通过对肺结核与肺外结核临床分离菌株基因分型结果的比较发现两者差异巨大,在肺结核中流行的菌株主要为Beijing基因型,约占65%。这与文献报道的在肺结核临床分离菌株中Beijing基因型占70%基本一致。但肺外结核临床分离株中有100%的分型一致性和成簇率,而且这一基因型并非是在中国流行最为广泛的北京基因型或其亚型。因此我们认为在肺外结核中,这一基因型别的结核分枝杆菌可能占据主要地位,较之其他更易引起肺外组织,尤其是骨组织的病变。


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