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《北京市结核病胸部肿瘤研究所》 2017年
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诱导PA-824和利奈唑胺双重耐药结核分枝杆菌及其应用

胡明豪  
【摘要】:目的体外诱导获得对PA-824、利奈唑胺(linezolid,LZD)及同时对PA-824和利奈唑胺(linezolid,LZD)耐药的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)菌株。方法分别将MTB标准菌株H37Rv在浓度2倍递增的含药(PA-824或LZD)固体培养基上传代培养,逐步诱导菌株对PA-824、LZD耐药,运用微孔板阿尔玛蓝(microplate alamar blue assay,MABA)法测定部分抗结核药物对PA-824、LZD耐药菌株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),对PA-824耐药菌株及LZD耐药菌株测序鉴定耐药相关基因(ddn和fgd1或rpl C基因)的突变情况。分别将诱导的PA-824耐药菌株和LZD耐药菌株在无药固体培养基上连续传代培养10代以观察耐药稳定性变化。然后将获得的PA-824耐药菌株、LZD耐药菌株在浓度2倍递增的含药(PA-824和LZD)固体培养基上进行传代培养,逐步诱导菌株同时对PA-824和LZD耐药(双重耐药菌株),运用MABA法测定PA-824和LZD对双重耐药菌株的MIC值,并对PA-824和LZD双重耐药菌株测序鉴定耐药相关基因(ddn或fgd1和rpl C基因)的突变情况。结果在含PA-824的培养基上,H37Rv经逐步诱导后获得5株单克隆MTB菌株,它们对PA-824的MIC值(20μg/ml)是诱导前(0.07μg/ml)8倍以上,且对TBA-354同时发生交叉耐药。测序结果显示fgd1基因未发生突变,但5株均检测到ddn基因突变。耐药株在无药固体培养基上连续传代10代后,MIC值无明显变化。在含LZD的培养基上,H37Rv诱导后获得的7株单克隆MTB菌株,其对LZD的MIC值范围是5.99~18.28μg/ml,为诱导前(0.25μg/ml)8倍以上,成功获得LZD耐药株,且对Sutezolid(PNU-100480)同时发生交叉耐药,7株菌株均检测到rpl C基因中T460C的突变。LZD耐药株在无药固体培养基上连续传代10代,MIC值有所下降(范围为4.71~7.47μg/ml),但均稳定在诱导前8倍以上。PA-824耐药菌株及LZD耐药菌株在浓度2倍递增的含药(PA-824和LZD)固体培养基上进行传代培养,成功得到26株PA-824和LZD双重耐药菌株,它们对PA-824和LZD的MIC值均超过诱导前8倍以上,并且部分菌株(如LP11和PL7)的耐药相关基因(ddn和rpl C基因)同时发生突变,成功获得对PA-824及LZD双重耐药的菌株。结论通过体外诱导可以获得同时对两种硝基咪唑类(Nitroimidazoles)药物和两种噁唑烷酮类(Oxazolidinones)药物均耐药的MTB菌株;MTB对硝基咪唑类药物的耐药可能与ddn基因突变有关;MTB对噁唑烷酮类药物的耐药可能与rpl C基因突变关系密切;MTB对硝基咪唑类和噁唑烷酮类药物的耐药稳定性较强。目的应用硝基咪唑-噁唑烷酮双重耐药结核分枝杆菌菌株,筛选抗结核活性良好的新化合物,并评估新化合物在小动物体内的抗结核活性。方法应用PA-824和LZD双重耐药的MTB菌株,进行新化合物的MIC实验。建立小鼠气溶胶感染模型,将小鼠随机分组并给药治疗。感染后第10天,将基线组小鼠解剖并进行肺组织CFU计数,治疗3周后将全部小鼠解剖,观察治疗情况并记录结果。结果应用双功能分子筛选模型,成功筛选出部分抗TB活性良好的新化合物。通过比较分析小鼠肺组织CFU计数的下降数值,评价了部分新化合物体内抗TB活性。结论PA-824和利奈唑胺双重耐药MTB菌株可用于筛选抗TB活性良好的新化合物。
【学位授予单位】:北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R52

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