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《北京市结核病胸部肿瘤研究所》 2017年
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结核分枝杆菌感染后自噬基因的表达水平和二甲双胍对自噬的干预的研究

吕子征  
【摘要】:结核分枝杆菌是一种胞内感染菌,故在体液免疫应答过程中产生的抗体对它的免疫作用较弱,而对细胞内的结核分枝杆菌无作用,因此天然免疫在结核分枝杆菌的感染过程中起到非常重要的作用。自噬作为天然免疫应答中非常重要的一部分,参与众多先天免疫信号的调控。自噬是低氧、营养缺乏、细胞器老化等各种原因导致的细胞的应激反应,自噬不仅能降解细胞内老化的细胞器和蛋白质,还能清除细胞内感染的细菌和病毒。自噬相关蛋白(autophagy related protein,ATG)之间互相协同,引起自噬体形成过程中的细胞膜变化,当抗原提呈细胞一旦吞噬了结核分枝杆菌由单层膜结构组成的吞噬囊泡在瞬间就会被LC3蛋白修饰,自噬蛋白相互激活修饰最终成熟为自噬小体,自噬小体与溶酶体互相融合形成自噬溶酶体,将吞噬的结核分枝杆菌降解。细胞的自噬除了对病原体具有直接的杀伤作用,而且自噬在抗原提成中发挥不可替代的作用,自噬作用可以促进位于自噬体表面的MHC-ΙΙ分子与病原微生物的抗原表位结合,并提呈给CD4+T细胞,自噬同时可以通过MHC-Ι将抗原提呈给CD8+T细胞。本研究收集了初治肺结核病患者和健康志愿者共24人,使用实时定量PCR的方法检测了初治结核病患者(病例组)和健康志愿者(对照组)之间的自噬基因的水平,本研究发现,对照组mTOR基因表达水平是病例组的(2.76±1.56)倍;对照组Rheb基因表达水平是病例组的(1.85±0.91)倍,可见初治结核病患者中这两种基因表达下调,可在一定程度上促进自噬水平,抵抗M.tb感染。除此之外,研究发现对照组BECN1基因表达水平是病例组的(2.23±1.52)倍,说明初治肺结核患者可以通过下调BECN1基因的表达从而抑制自噬的发生,通过这一基因水平的变化可以得出BECN1通路和mTOR通路对自噬的调节是不一致的,甚至有可能是相反的调节。本研究同时检测了使用H37Rv感染THP-1细胞后自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12和Rheb在感染后30min、90min、4h、10h和24h的表达水平,研究发现ATG5、ATG7和ATG12在THP-1细胞感染H37Rv后30min后即表达上调,ATG5和ATG7基因在感染10h左右达到了基因表达的最高峰,自噬的调节基因Rheb表达水平在实验早期并没有显著的升高或者下降,在感染的时间段内(30min到24h),自噬的基因Rheb表达水平与感染前相比变化在2倍以内,故可以认为在体外实验中在H37Rv感染早期,Rheb基因没有明显变化;使用二甲双胍干预后的THP-1细胞在感染了BCG菌株后,自噬相关基因Rheb的表达水平在实验组(使用二甲双胍干预)和对照组(不使用二甲双胍干预)并没有显著的变化,而自噬相关基因mTOR在感染30min时有显著的表达下调,故二甲双胍可能在THP-1细胞在感染了BCG菌株早期抑制了自噬基因mTOR表达;除此之外,使用活细胞工作站观察使用BCG菌株感染后含有二甲双胍和不含有二甲双胍药物的细胞中mRFP-GFP-LC3B的含量,发现二甲双胍还可以促进自噬小体和溶酶体的融合,促进了THP-1细胞对BCG菌株的自噬。
【学位授予单位】:北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R52

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