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《北京市结核病胸部肿瘤研究所》 2017年
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亲环素A在非小细胞肺癌转移中的作用及其相关机制的初步探讨

郭易楠  
【摘要】:背景与目的:肺癌因其高发病率和死亡率,在中国乃至世界范围内依然是一个重大的健康问题。肺癌普遍发病隐匿,早期症状不明显,因此在发病初期易被忽视。加之肺癌的早期诊断及治疗进展缓慢,5年生存率仅为18%。大部分肺癌患者在初次就诊时,已经发生了转移,这也是目前肺癌疗效不佳的一个主要原因。作为肿瘤的六大生物学特性之一,“转移”一直以来都是导致肿瘤复发以及患者死亡的主要原因。因此,研究肿瘤发生转移的机制,阐明参与肿瘤转移的信号通路,对控制肿瘤的复发和转移有着重要的意义。亲环素A作为最早被发现的亲环素家族成员,在肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中均呈高表达状态。研究发现,亲环素A在这些肿瘤的发生和发展过程中均发挥着重要的作用。其中,肿瘤的转移更是与亲环素A的表达水平有着密切的关系。然而,目前针对亲环素A在肺癌的转移过程中的作用及其相关机制的研究尚比较少。本课题组前期研究发现,通过RNA干扰和使用抑制剂的方法,抑制非小细胞肺癌细胞中亲环素A的表达水平后,细胞的迁移和侵袭能力均受到了抑制,这提示我们,亲环素A可能能够促进非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭。随后我们发现,在抑制了非小细胞肺癌细胞中亲环素A的表达水平之后,MAPK信号通路中的一个重要分子——P38的磷酸化水平也受到了明显抑制,这提示我们亲环素A对非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力的调控,可能是通过P38 MAPK信号通路来实现的。因此,本课题将分别通过体外和体内实验来进一步研究亲环素A在非小细胞肺癌转移过程中的作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法:首先,在“亲环素A在非小细胞肺癌转移过程中的作用”的研究中,我们通过慢病毒感染的方法,在两种人非小细胞肺癌细胞H1299和A549中构建亲环素A低表达细胞株,并在此基础上构建亲环素A过表达的细胞株,及其对照细胞;然后通过划痕实验和Transwell实验的方法,观察亲环素A的表达水平对两种人非小细胞肺癌细胞H1299和A549的迁移和侵袭能力的影响;同时通过Western-blot的方法来观察亲环素A的表达水平的变化对EMT相关蛋白表达水平的影响。最后通过动物实验的方法,构建非小细胞肺癌小鼠转移模型,来进一步探讨亲环素A的表达水平对非小细胞肺癌转移的影响。接着,在“亲环素A在非小细胞肺癌转移过程中的作用机制的探讨”的研究中,我们使用P38抑制剂SB203580,分别对亲环素A低表达和高表达的非小细胞肺癌细胞进行处理,一方面通过细胞迁移和侵袭实验,观察两种抑制剂在亲环素A表达水平不同的情况下,对非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;另一方面通过Western-blot的方法来检测两种抑制剂在亲环素A表达水平不同的非小细胞肺癌细胞中,对EMT相关蛋白表达水平的影响。结果:1.在A549和H1299两种非小细胞肺癌细胞中,通过慢病毒感染,成功构建了亲环素A低表达(CypA-KD)和过表达(CypA-KD-OE)细胞株,及其各自的对照细胞;2.划痕实验结果显示,与对照组H1299 NC细胞相比,H1299 Cyp A-KD组细胞的迁移能力明显降低(P0.01),而H1299 Cyp A-KD-OE组细胞的迁移能力也明显高于对照组细胞H1299 CypA-KD-Vector(P0.01);Transwell迁移实验结果同样表明,与对照组细胞H1299/A549 NC相比,H1299 CypA-KD组(P0.001)和A549 CypA-KD(P0.05)组细胞的迁移能力也显著降低,同时H1299CypA-KD-OE组细胞(P0.001)和A549 CypA-KD-OE组细胞(P0.05)的迁移能力较对照组细胞H1299/A549 CypA-KD-Vector相比明显增高;然而,Transwell侵袭实验的结果则显示,无论是在A549还是H1299细胞中,亲环素A的表达水平对两者的侵袭能力都没有明显的影响;3.Wester-blot的结果显示,亲环素A的表达水平降低后,β-catenin,Vimentin和Snail蛋白的表达水平在H1299和A549细胞中都受到了明显的抑制,而随后在亲环素A过表达之后,三者的表达水平较对照组又明显升高。4.非小细胞肺癌小鼠转移模型的结果显示,14周后,A549组和A549CypA-KD-OE组的各自有5/5和5/5只小鼠肺部出现了转移病灶,而A549CypA-KD组肺部出现转移病灶的小鼠数量为0/5只;此外,在A549和A549CypA-KD-OE组中,各有一只小鼠出现了骨转移。5.在H1299和A549细胞中,亲环素A表达水平降低后,P38的磷酸化水平都出现了明显的降低,而当亲环素A的表达水平再次上调时,P38的磷酸化水平也随之上升,差异均具有统计学意义(P0.05);6.使用P38抑制剂SB203580处理细胞后,H1299 CypA-KD-OE细胞的迁移能力较对照组(DMSO)明显降低(划痕实验P0.01,Transwell迁移实验P0.01),而H1299 CypA-KD细胞的迁移能力与对照组(DMSO)相比,没有显著的统计学差异;7.经P38抑制剂SB203580处理后,H1299 CypA-KD-OE组细胞中,β-catenin,Vimentin和Snail蛋白的表达水平于对照组(DMSO)相比均受到明显的抑制,并且差异具有统计学意义(P0.05);而在H1299 Cyp A-KD组的细胞中,与对照组相比,三者的表达水平并未明显受到SB203580的影响。结论:1.体外实验的结果表明,亲环素A能够明显促进非小细胞肺癌细胞的迁移能力,同时能够促进细胞发生EMT;2.动物实验的结果表明,亲环素A能够促进非小细胞肺癌在体内发生转移;3.P38是亲环素A介导的非小细胞肺癌转移过程中的重要因素,因此亲环素A在非小细胞肺癌转移过程中的作用能够通过P38 MAPK信号通路来实现的。
【学位授予单位】:北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R734.2

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