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《北京市结核病胸部肿瘤研究所》 2017年
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重症继发性肺结核患者相关特异性蛋白标志物的筛选和临床研究

刘秋月  
【摘要】:第一部分行机械通气的肺结核并呼吸衰竭患者的死亡因素分析目的本研究观察行机械通气、但最终死亡的肺结核合并呼吸衰竭患者的临床特征,探讨与其死亡相关的风险因素,为肺结核合并呼吸衰竭患者疾病进展、加重、死亡提供预警和预后指标,从而为其合理治疗提供依据。方法采用回顾性分析的方法,收集2010年01月~2014年05月在首都医科大学附属北京胸科医院重症监护室(intensive care unit,ICU)住院的120例肺结核合并呼吸衰竭患者的临床资料。按照临床转归将纳入患者分为生存组及死亡组。首先对收集的资料进行单因素分析,继而将单因素分析中有统计学意义的因素作自变量,以死亡作为因变量,行多因素Logistic回归分析,以P0.05记为差异有统计学意义。最后,应用回归结果进行判别分析,建立死亡风险模型。对此模型进行受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curves,ROC)分析,判断其临床价值。结果1.120例肺结核合并呼吸衰竭患者的平均年龄58.67+20.81岁(18.0–92.0岁),其中男性88例,占73.33%。ICU病死率为49.20%。一般人口学资料在生存组与死亡组间无统计学差异(P0.05)。2.入住ICU时,死亡组感染中毒性休克、肾功能不全等并发症和真菌感染的发生率高于生存组,呼吸频率、C反应蛋白、血肌酐、血乳酸、Apache II评分均高于生存组;而其体温、平均动脉压、身体质量指数(body mass index,BMI)、血浆白蛋白水平低于生存组,均有统计学意义(P0.05)。3.入住ICU行机械通气治疗24h后,死亡组所需吸氧浓度、平均动脉压增加的幅度高于生存组,而其p H、氧合指数(Pa O2/FIO2)、动脉血氧分压(Pa O2)、治疗前后Pa O2/FIO2和Pa O2增加幅度低于生存组,均有统计学差异(P0.05)。余指标在两组间无统计学差异(P0.05)。4.Logistic多因素分析,发现ICU治疗前的Apache II评分、呼吸频率、血乳酸水平、C反应蛋白及机械通气24h后Pa O2/FIO2是行机械通气治疗的肺结核合并呼吸衰竭患者的独立死亡因素。据此获得肺结核合并呼吸衰竭患者死亡风险判别分析模型为Z=0.54*氧合指数(24 h)-0.32*Apache II评分-0.72*呼吸频率-0.39*乳酸-0.08*C反应蛋白。其AUC为0.903,敏感性为72%,特异性为95.6%。结论肺结核合并呼吸衰竭患者即使经机械通气治疗后仍存在较高的病死率。机械通气治疗前的APACHEⅡ评分、呼吸频率、血乳酸水平和C-反应蛋白水平以及机械通气24小时后的Pa O2/FIO2是其死亡的独立危险因素。基于这些风险因素建立的肺结核合并呼吸衰竭患者死亡风险模型预测其死亡风险的敏感性和特异性较高,可以协助指导临床医生评价预后。第二部分重症继发性肺结核蛋白质组学的初步研究目的方法采用label-free定量蛋白质组学技术对重症继发性肺结核患者的蛋白质组学进行检测和筛选,分析和探讨其特征与功能,确定重症继发性肺结核患者的候选差异蛋白。为进一步阐明继发性肺结核进展、加重机制提供新的分子标识,为其病变进展、加重的预警和预测评估提供新的蛋白标志物。1.收集2015年03月-2015年12月在首都医科大学附属北京胸科医院住院的9例重症继发性肺结核患者(severe secondary pulmonary tuberculosis,STB)、9例轻症继发性肺结核患者(mild secondary pulmonary tuberculosis,MTB)以及9例同期北京市疾病控制中心健康查体者(non-mycobacterium tuberculosis infected healthy controls,NC)的外周血血浆标本。2.采用label-free定量蛋白质组学技术对3例STB患者、3例MTB患者、3例NC者的血浆进行蛋白提取、质谱检测。利用基因本体论(gene onology,GO)对差异蛋白进行生物信息学分析。利用京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对差异蛋白进行代谢通路分析。3.根据蛋白差异倍数、是否与结核、炎症和免疫等相关、是否有抗体、是否有商品化试剂盒和生物信息分析等条件,确定候选血浆差异蛋白。应用蛋白质印迹法(western blot)对6例STB患者、6例MTB患者、6例NC者的候选血浆差异蛋白进行检测,验证Label free结果的可靠性。结果1.应用label free蛋白质组技术分离鉴定出399个血浆差异蛋白与继发性肺结核相关,153个血浆差异蛋白与重症继发性肺结核相关。其中,继发性肺结核患者高表达的血浆差异蛋白为232个,低表达的血浆差异蛋白为167个;重症继发性肺结核患者高表达的血浆差异蛋白为82个,低表达的血浆差异蛋白为71个。2.对重症继发性肺结核患者血浆差异蛋白进行GO分析,发现其主要定位于细胞组分(36.3%)和细胞器(27.5%),主要分子功能集中在结合(36.6%)及催化活性(26.2%),主要参与代谢过程(23.2%)和各种细胞进程(18.8%)。KEGG代谢通路分析显示血浆差异蛋白最为富集的信号通路是黏着斑反应通路。STRING蛋白质相互作用分析发现,差异蛋白在物理或功能上存在相互作用,并构成一个复杂的相互作用网络。3.根据蛋白差异倍数、是否与结核、炎症和免疫等相关、是否有抗体、是否有商品化试剂盒和生物信息分析等条件,筛选出6个上调蛋白质和2个下调蛋白质。前者包括血浆α-1-酸性糖蛋白前体-1(alpha-1-acid glycoprotein 1precursor,ORM1)、α-1-酸性糖蛋白前体-2(alpha-1-acid glycoprotein 2 precursor,ORM2)、白细胞介素1家族成员6(interleukin-1 family 6,IL1F6)、钙结合蛋白S100A9(protein S100-A9,S100A9),Ⅲ型胶原蛋白(collagen alpha-1(III)chain preproprotein,Collagen III)和亲β细胞素的前体蛋白(probetacellulin precursor,BTC),后者包括超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和重组人酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase Lyn isoform B,LYN)。Western blot验证结果显示ORM1、ORM2、IL1F6、S100A9、Collagen III和SOD1表达变化趋势与Label free蛋白质组定量检测结果一致,而LYN表达趋势与Label free结果不同,BTC水平在重症与轻症肺结核组间无统计学差异。鉴于ORM1,Collagen III缺乏相关商业抗体试剂盒,最终确定S100A9、IL1F6、ORM2和SOD1作为重症肺结核患者的血浆差异蛋白进入下一步研究。结论应用Label free定量蛋白质组技术分离鉴定出153个血浆差异蛋白与重症继发性肺结核相关。其主要定位于细胞组分及细胞器,主要功能集中在结合和催化活性,主要参与代谢过程和各种细胞过程等进程,蛋白最为富集的信号通路是黏着斑反应通路,在继发性肺结核病变进展加重的过程中发挥了重要作用。第三部分血浆差异蛋白预测继发性肺结核病变进展和死亡的临床价值目的观察四个血浆差异蛋白(S100A9、ORM2、IL1F6、SOD1)对肺结核患者病变进展、加重的影响,探讨其可能的作用机制;评估其对重症继发性肺结核预警和预后的临床价值。为进一步阐明继发性肺结核进展、加重机制提供依据,为其病变进展、加重的预警和预测评估提供新方法和新指标。方法1.收集2015年03月-2015年12月在首都医科大学附属北京胸科医院住院的72例重症继发性肺结核(STB)患者、71例轻症继发性肺结核(MTB)患者和41例同期北京市疾病控制中心健康查体者(NC)的外周血血浆标本。2.应用酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对上述受试者的四个血浆差异蛋白进行检测,比较其表达量变化趋势与Label free和Western blot的一致性;应用双变量Spearman分析相关影响因素,ROC曲线评估其预测、评估重症肺结核的临床价值。3.基于四个血浆差异蛋白、应用分类决策树(Classification and Regression Tree,CART)建立重症肺结核的预警模型。(1)分别随机抽取50例STB患者、51例MTB患者及29例NC者建立模型,并应用ROC曲线对此模型的临床价值进行验证分析。(2)分别随机抽取21例STB患者、21例MTB患者及12例NC者对此模型进行盲法验证,进一步评估其临床价值。(3)随机抽取85例纳入的继发性肺结核患者,按照决策树模型诊断为重症继发性肺结核(35例)和轻症继发性肺结核患者(50例),追踪随访并动态观察其入院时、治疗1月末,2月末及6月末临床相关指标的变化,评价此预警模型对重症继发性肺结核病病变进展、疗效的预警作用。4.将纳入的143例继发性肺结核患者按照临床转归分为死亡组和生存组,观察四个血浆差异蛋白的变化特点,采用ROC曲线评估其预测死亡的临床价值。基于四个血浆差异蛋白、应用分类决策树建立继发性肺结核患者的死亡预警模型,并采用ROC曲线评价其临床价值。结果1.轻症肺结核患者S100A9、ORM2、IL1F6浓度高于健康组,而其SOD1浓度低于健康组;重症肺结核组S100A9、ORM2、IL1F6浓度高于轻症肺结核组,而其SOD1浓度则低于轻症肺结核组,均有统计学差异(P0.05)。相关性分析显示重症肺结核患者血浆S100A9水平与血沉呈正相关(r=0.268,p=0.001)、与Pa O2呈负相关(r=-0.398,p0.001);ORM2水平与C反应蛋白及血沉水平呈正相关(r=0.183,p=0.023;r=0.285,p0.001);IL1F6水平与血浆白蛋白水平呈负相关(r=-0.182,p=0.031);SOD1水平与Pa O2/FIO2及Pa O2呈正相关(r=0.307,p=0.043;r=0.268,p=0.032)。分别应用四个血浆差异蛋白预警重症肺结核,ROC曲线下面积(AUC)在0.525-0.891,评估和预警准确性由高到低排序依次为S100A9、ORM2、SOD1、IL1F6。2.基于四个血浆差异蛋白、应用分类决策树建立的重症肺结核的预警模型(1)AUC为0.941,特异性为90.38%,敏感性为91.84%;(2)对此模型盲法验证特异性为90.48%,敏感性为80.96%。(3)按照此预警模型随机抽取的85例继发性肺结核患者分别诊断为重症肺结核(35例)和轻症肺结核(50例),随访过程中,8例重症肺结核和13例轻症肺结核患者失访。最终,27例重症肺结核和37例轻症肺结核患者纳入本研究。其中,模型诊断的重症继发性肺结核组血沉、C反应蛋白、WBC、Pa CO2高于模型诊断的轻症肺结核组,而其淋巴细胞、血红蛋白、白蛋白、Pa O2/FIO2、Pa O2低于模型诊断的轻症肺结核组。抗结核治疗后,模型诊断的重症肺结核组1月末、2月末及6月末痰菌阴性率、病变吸收率和空洞闭合率均低于模型诊断的轻症肺结核组,而其病死率、治疗1月末的血浆白蛋白及治疗1、2月末时C反应蛋白平均值高于模型诊断的轻症肺结核患者组。均有统计学差异(P0.05)。3.纳入的143例继发性肺结核患者中,病死率为10.49%,重症肺结核组的病死率及及一月内病死率明显高于轻症肺结核组。与生存组相比,死亡组患者的血浆S100A9、ORM2、IL1F6水平明显升高,而SOD水平明显降低,均有统计学差异(P0.05)。其预测死亡的AUC为0.436~0.767,其中,SOD1的AUC0.5,而S100A9的AUC达到0.767。4.基于四个血浆差异蛋白、应用分类决策树建立的肺结核患者的死亡预警模型,AUC为0.861,特异性为78.86%,敏感性为83.21%。结论1.重症继发性肺结核患者血浆S100A9、ORM2和IL1F6高表达,SOD1低表达,可能与炎症损伤和低氧血症等相关。四个血浆差异蛋白均具有对重症肺结核发生、进展的预警价值,以S100A9为最佳。2.基于四个血浆差异蛋白、采用决策树模型建立的重症肺结核患者评估、预警模型的敏感性、特异性和准确率较高,优于单一血浆差异蛋白的预警价值。可较好的反映重症肺结核患者的临床特征,对病变进展、疗效预测、不良预后具有较好的预警价值。3.继发性肺结核死亡组患者血浆S100A9、ORM2、IL1F6高表达,而其SOD1低表达,提示其表达水平可能与死亡相关。基于四个血浆差异蛋白、采用决策树模型建立继发性肺结核的死亡评估模型,优于单个血浆差异蛋白预测肺结核患者死亡的临床价值,有助于评估预后。
【学位授予单位】:北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R521

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