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《北京市结核病胸部肿瘤研究所》 2017年
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NSCLC患者T细胞表面CTLA-4、PD-1、TIM-3的表达水平和意义的研究

郭洋  
【摘要】:随着近几十年来肿瘤免疫学和分子生物学的发展和进步,人们认识到机体的免疫状态以及肿瘤内部免疫微环境的动态改变存在于肿瘤发生与发展的整个过程。早在20世纪70年代,即有学者提出免疫监视理论:在正常状态下,机体免疫系统能够识别和杀伤异常细胞,保持正常细胞增殖和遗传物质的传递;当机体免疫功能抑制或异常细胞演进导致免疫系统无法识别异常细胞时,异常细胞增殖可形成肿瘤。21世纪初期出现的肿瘤免疫编辑学说是近十几年来肿瘤免疫研究的背景,其阐述了肿瘤发生及发展过程中大体上经历的三种免疫状态:清除-平衡-逃逸;认为免疫系统与肿瘤细胞之间是一个动态的互相改变及被改变的过程。T淋巴细胞表型和功能的动态改变在整个过程中起着重要的作用。在免疫逃逸时相,肿瘤细胞能够逃逸T细胞介导的识别和杀伤作用,原因在于机体和肿瘤内部存在大量免疫抑制性分子及抑制性T细胞。免疫治疗开启了肿瘤治疗史上新的里程,其针对对象和失败原因均是肿瘤的免疫抑制状态,特别是肿瘤内部微环境的免疫抑制状态。肿瘤微环境中聚集了大量调节性T细胞(regulatory T cell,T-reg)及髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC);诸多抑制性分子的高表达及细胞因子的异常分泌诱导形成了大量的耗竭性T细胞,共同构筑了抑制性免疫环境,从而使肿瘤细胞得以逃逸免疫系统的杀伤。T-reg细胞是机体重要的免疫抑制性细胞,可抑制细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)、自然杀伤细胞(natural killer,NK)及树突状细胞(dendritic cell,DC)等多种免疫效应细胞的功能,是肿瘤免疫逃逸的关键因素。T-reg细胞被肿瘤细胞诱导募集和增殖,已证实在多种肿瘤中T-reg细胞数量上升,进而抑制机体的抗肿瘤反应,且T-reg细胞水平与患者肿瘤进展及预后相关。研究发现NSCLC患者肿瘤组织中浸润的T-reg细胞和外周血中T-reg细胞比例明显高于正常人,且T-reg细胞的浸润比例与肿瘤分期和预后相关。然而,在NSCLC患者中,T-reg细胞表面抑制性分子的表达水平与肿瘤的关系尚未见报道。除T-reg细胞,MDSC等抑制性细胞外,机体和肿瘤内部还存在大量失去免疫功能的T细胞,表现为耗竭性T细胞,其表面持续性高表达抑制性分子或抑制性受体,如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4),程序性死亡蛋白1(programmed death-1,PD-1),T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3,TIM-3)等作为免疫检查点共同调控着免疫细胞的功能和增殖凋亡。在正常情况下,免疫检验点参与维持自身免疫耐受和保护正常组织免受免疫系统杀伤。在肿瘤患者中,由于长期不充分接触有效的肿瘤抗原,淋巴细胞会异常表达某些抑制性分子,从而造成肿瘤特异性T细胞发生功能紊乱,导致T细胞增殖障碍或同时减少白介素2(interleukin-2,IL-2),干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ),肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子的分泌。免疫检查点蛋白已经成为了肿瘤免疫治疗的靶点,以期逆转肿瘤免疫抑制状态。大量的临床数据显示针对共抑制信号的抗体能够提高肿瘤特异性T细胞的应答。免疫抑制性分子的效应发挥并非是完全独立的,同一淋巴细胞或不同类型淋巴细胞表面的抑制性分子的功能和表达相互影响、调控;下游通路也存在重叠和交叉,相互之间有协同或拮抗效应,共同构成具有诸多交集的抑制性分子网络。在NSCLC患者体内,CTLA-4,PD-1和TIM-3在不同类型T细胞表面的表达水平如何?这三种负性协同刺激分子之间存在什么样的关系,与患者临床病理特征关系如何?其围手术期表达水平如何动态变化?为了初步探讨这些问题,我们设计了该研究,包括三部分内容:第一部分:应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分别检测64例NSCLC患者和18例健康志愿者外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及T-reg细胞表面CTLA-4、PD-1和TIM-3表达水平,分析其与患者临床病理特征之间的关系,以及相关免疫指标之间的相关性。结果显示:NSCLC患者外周血中CD4+比例、CD4+/CD8+比值分别低于健康组,T-reg/CD4+比值、T-reg比例明显高于健康组。NSCLC患者外周血CD3+T细胞和CD4+T细胞表面PD-1+、TIM-3+表达率分别高于健康组;CD8+T细胞表面CTLA-4+和PD-1+表达率分别高于健康组;T-reg细胞表面CTLA-4+和TIM-3+表达率分别高于健康组。T-reg/CD4+比值和T-reg细胞表面CTLA-4表达率与NSCLC患者的TNM分期相关,CD4+T细胞表面PD-1+和TIM-3+表达率分别与NSCLC患者的淋巴结转移状态相关。T-reg/CD4+比值与CD4+T细胞表面PD-1+表达率、T-reg细胞表面CTLA-4+表达率、T-reg细胞表面TIM-3+表达率均显示正相关;T-reg细胞表面CTLA-4+表达率与T-reg细胞表面TIM-3+表达率呈正相关,CD8+T细胞表面的PD-1+表达率与TIM-3+表达率呈正相关。第二部分:采用多色标记定量免疫荧光法(multiplex quantitative Immunofluorescent,QIF)检测了21例NCSLC患者术后肿瘤组织中肿瘤浸润T淋巴细胞表面PD-1和TIM-3的表达水平,分析PD-1和TIM-3在肿瘤浸润T淋巴细胞表面共表达的情况以及这些指标与患者临床病理特征的关系。结果显示,PD-1和TIM-3在NSCLC患者肿瘤浸润T淋巴细胞表面高表达,且TIM-3和PD-1普遍存在共表达现象;与本研究第一部分相同患者外周血中CD3+T细胞表面PD-1+和TIM-3+表达率相比分别明显升高;并且CD3+T细胞表面PD-1+、TIM-3+表达率在外周血与肿瘤组织中相关;PD-1+TIM-3+T细胞代表了肿瘤浸润T淋巴细胞的主要组成部分。CD3+T细胞表面PD-1+表达率与淋巴结转移相关,CD3+T细胞表面TIM-3+表达率和肿块直径相关。PD-1+TIM-3-CD3+T细胞与患者淋巴结转移相关。PD-1+TIM-3+CD3+T细胞与淋巴结转移及p TNM分期相关。第三部分:应用流式细胞术检测41例可手术NSCLC患者术前1天、术后1天、术后3天、术后7天、术后28天5个时间节点外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T-reg细胞表面CTLA-4、PD-1和TIM-3的表达水平,分析不同时间节点共抑制分子表达水平的变化,并探讨其与手术治疗的关系。结果显示:与术前1d对比,术后1d、3d、7d的外周血中CD3+比例、CD4+比例和CD4+/CD8+比值均明显降低。术后28d CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值显著高于术前。术后3d CD8+T细胞水平明显高于术前。术后各时间点外周血T-reg/CD3+比值明显低于手术前。术后1d T-reg/CD4+T比例高于手术前;术后28d T-reg/CD4+比值明显低于手术前。与术前1d相比,术后7d、28d CTLA-4在CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T-reg细胞表面阳性表达率降低。术后各时间点外周血中PD-1在CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T-reg细胞表面阳性表达率明显低于手术前。与术前1d相比,术后7d、28d TIM-3在外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T-reg细胞表面阳性表达率降低。本文发现与健康人群相比,NSCLC患者外周血中淋巴细胞表面CTLA-4和(或)PD-1和(或)TIM-3阳性表达率升高;部分共抑制分子和抑制性细胞表达水平的升高与NSCLC患者的TNM分期或淋巴结转移状态具有相关性;提示NSCLC患者整体处于免疫抑制状态,且外周血中免疫抑制因素可能促进肿瘤转移。T-reg细胞表面TIM-3和CTLA-4的相关性提示TIM-3也可能是T-reg细胞的表面标记分子;T-reg细胞可能是参与肿瘤进展的重要因素,靶向清除T-reg细胞可能增强抗肿瘤免疫。肿瘤组织内TIM-3和PD-1的共表达现象揭示了肿瘤局部浸润T淋巴细胞多为高度耗竭性T细胞,并且参与肿瘤细胞免疫逃逸、促进疾病进展。多色标记免疫荧光技术和多光谱组织成像分析系统的使用有助于深入认识肿瘤免疫抑制网络,为筛选新靶点和免疫检查点抑制剂的优化应用提供依据。手术会短暂抑制机体免疫功能,也能有效降低共抑制分子的表达,减轻肿瘤源性免疫抑制,术前及紧随术后可能是联合使用免疫检查点抑制剂的合适时机。
【学位授予单位】:北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R734.2

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