甲型流感病毒核输出蛋白的原核表达及其抗体制备

【摘要】：研究背景:甲型流感病毒属于正粘病毒科,可以引起人畜共患疾病。甲型流感病毒可以通过抗原漂移不断地变异来逃避免疫系统的攻击,引起小范围的流行;或通过抗原更换产生新的毒株引起全球性的流感大流行。目前的流感疫苗作用有限,同时伴随着新的耐药株不断出现,开发流感病毒新的药物靶点也是研究热点之一。随着对流感病毒基础研究的深入,核输出蛋白(Nuclear export protein,NEP)越来越被人们所了解和重视。NEP是一个由甲型流感病毒第八段基因编码的约为14kD的蛋白。NEP的主要功能是负责病毒核糖核蛋白(Viral ribonucleoproteins,vRNPs)复合体的出核,有希望成为预防和治疗流感病毒的新靶点。利用抗体来研究蛋白质的功能是分子生物学经典的方法,包括免疫沉淀、免疫印迹等。尤其是单克隆抗体,凭借自身特异性好的优点,更是受到研究者的青睐。研究目的:获得NEP基因,制备和纯化NEP重组蛋白,为杂交瘤细胞的制备和抗体鉴定提供基础材料。制备抗NEP单克隆抗体,为流感病毒的基础研究建立基础。研究方法:(1)本研究通过RT-PCR和PCR技术从流感病毒基因组克隆NEP基因。(2)构建两个重组质粒,pET-28a-NEP和pGEX-4t-1-NEP,利用原核表达系统表达NEP-HIS和GST-NEP融合蛋白,并纯化目的蛋白。(3)用GST-NEP来免疫小鼠,细胞融合后用NEP-HIS来筛选分泌抗NEP的抗体的杂交瘤细胞株。最后用免疫印迹的方法检测单克隆抗体的特异性。研究结果:(1)用RT-PCR方法克隆了流感病毒的NS基因,接着以NS基因为模板,分段PCR成功克隆NEP基因。(2)构建了 pET-28a-NEP和pGEX-4t-1-NEP重组质粒,并在大肠杆菌内成功表达了 NEP重组蛋白,最后纯化了目的蛋白。(3)用GST-NEP免疫小鼠,经过3轮的常规免疫,获得了满意的血清效价。小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成功,建立了杂交瘤细胞株。用NEP-HIS蛋白筛选阳性克隆,最后获得了 2株能稳定分泌抗NEP抗体的杂交瘤细胞株,命名为1E10和2A4。免疫印迹显示抗体1E10能特异地与病毒的NEP结合。结论:利用基因工程的方法构建pET-28a-NEP和pGEX-4t-1-NEP重组质粒,并获得了纯度较高的重组蛋白。成功获得了 2株能稳定分泌抗NEP抗体的杂交瘤细胞,最后通过免疫印迹验证其中1株能与病毒编码的NEP蛋白结合。为今后进行流感病毒基础研究,体外诊断,抗流感药物的研发等多个领域打下基础。