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《江汉大学》 2017年
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基于近红外响应系统的细胞捕获/释放研究

叶海霞  
【摘要】:人体外周血循环系统中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是肿瘤转移和复发的重要标志,其研究对肿瘤早期诊断及术后监测有着重大作用。然而,肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞的数量极少,大约10~9个血细胞中仅有几个CTCs,这便要求分离技术能高效准确地从大量非目标细胞中识别极少的癌细胞。虽然目前已经出现一些高效的分离技术,但是,分离得到的CTCs留在原基质上不便于的后续检测也是一个需要挑战的难点。因此,必须建立温和的CTCs释放体系,获取纯度高、活力好的CTCs,方便对其进行后续培养及相关的检测。本文提出了将上转换发光材料(Upconversion Nanoparticles,UCNPs)与光敏感型聚合物结合,在温和的近红外的辐照下,利用光敏感性聚合物的光致异构性或者光致断链特性实现CTCs的释放,对细胞的活性影响较小,并且利用光敏聚合物独特的可逆转变特性实现CTCs的“捕获-释放”循环,使得光敏芯片可重复使用,与可持续发展社会紧密结合。具体工作如下:1.利用简便的水热法成功制备了两种不同掺杂元素的上转换纳米棒β-NaYF_4:Yb~(3+)/Er~(3+)/Gd~(3+)和β-NaYF_4:Yb~(3+)/Tm~(3+),考察了反应温度、反应时间和稀土上转换的浓度对纳米棒的粒径、晶体类型和发光性能的影响。采取水热法合成出的UCNPs具有粒径均匀、晶相均一和发光强度高等特点,在生物医学应用中更有优势。两种UCNPs都是以NaYF_4作为发光基质材料,合成了双掺杂的β-NaYF_4纳米棒。通过扫描电子显微镜和X射线衍射的表征结果,可以得到上转换纳米棒的长度、直径和晶型。在980 nm近红外(Near Infrared,NIR)的激发下,在可见光区和紫外光区有不同的发射光,掺杂Tm~(3+)的UCNPs转换得到的紫外光可以调控光敏聚合物实现异构或者断链。另外,采用经典的St?ber方法在合成的上转换纳米棒表面包覆一层SiO_2,使其更容易进行水溶性修饰,具有更好的生物相容性。2.我们探究了与PAA-Azo光致异构不同的光致断链poly(o-nitrobenzyl-methacrylate-co-methyl-methacrylate-co-poly-(ethylene-glycol)-methacrylate)(PNMP)聚合物在细胞释放中的效果。利用该聚合物中的硝基苄基在NIR的照射下,发生断链后对pH的敏感程度,pH7聚合物迅速溶解,pH5聚合物不溶解,实现对细胞释放调控。傅利叶红外及核磁的结果显示,合成的目标产物与设计一致。在构筑光敏聚合物多层膜后,我们采用了SEM-mapping表征了修饰抗体的过程,结果显示,Traut`s试剂的-SH的硫元素被检测出,说明anti-EpCAM可以实现进一步修饰,进而特异性的识别CTCs。采用980 nm的NIR照射PNMP,通过倒置荧光显微镜观察发现,在pH=7.4的PBS溶液中,PNMP发生断链反应后溶解在PBS溶液中,细胞得以释放。通过改方法,可以更加有效的实现细胞的释放,更进一步提高释放效率,这种技术可以提高CTCs源性的分子特征和功能分析,有助于深入了解肿瘤行为,从而为肿瘤治疗提供重要的信息。3.利用层层自组装的方法将偶氮苯接枝的聚丙烯酸(PAA-Azo)固定在修饰了氨基的石英片上,通过环糊精和偶氮苯的络合包结,实现光开关的制备。首先,我们结合β-CD-RhB来模拟细胞释放实验,在980 nm的NIR辐照下,被曝光的部分实现图案化,说明利用近红外调控偶氮苯分子发生顺反异构是可行的。然后,利用anti-EpCAM与乳腺癌细胞(MCF-7)表面抗原之间的特异性,有效识别MCF-7。最后,基于温和近红外光对光敏分子偶氮苯的调控实现CTCs的“捕获-释放”可逆循环,释放效率高达90%。此技术在满足CTCs高效捕获的同时实现其无损伤释放,能获得具有较高生物活性的MCF-7,对后续的分子生物学分析有着重大意义。这种可循环利用芯片实现了可持续发展,节约了成本,使得该技术推向临床更近了一步。
【学位授予单位】:江汉大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R318;O657.33

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