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吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡及其机制研究

董瑞红  
【摘要】:背景与目的 白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病,随着对白血病的不断研究,可以从形态学、细胞化学、细胞免疫学、细胞遗传学、分子生物学方面对白血病进行诊断分型,评估预后,取得了较大的进展。临床治疗白血病仍以化学治疗为主,化疗虽然能迅速杀灭快速增殖的白血病细胞,但化疗诱导白血病缓解率低、缓解后复发及化疗的相关并发症等问题尚待解决。由于化疗药物自身的特性、白血病细胞对它的敏感性以及患者的耐受性等原因,化疗不能杀灭体内所有的白血病细胞,残留的白血病细胞是白血病化疗后难以完全缓解或缓解后复发的重要原因之一。由于化疗药物在杀灭白血病细胞的同时,也杀死大量人体正常细胞,造成机体免疫功能下降,各系统并发症出现,增加了化疗相关死亡率,影响患者的生存质量。研究证明全反式维甲酸、三氧化二砷能诱导早幼粒白血病细胞凋亡并使其分化成成熟的粒细胞,但不影响正常组织和细胞。全反式维甲酸、三氧化二砷临床应用开创了治疗早幼粒细胞性白血病的全新方法。靛玉红治疗慢性粒细胞白血病,对急性粒细胞白血病也有一定的作用。中药协助化疗药物杀灭白血病细胞,并促进其凋亡,提高对难治、复发急性白血病患者的治疗效果。研究表明中药的这种作用主要源于其中的生物碱成分,纯化的生物碱联合化疗药治疗白血病可能是诱导缓解、逆转白血病多药耐药的一条可行的途径。这种治疗方法可望减少治疗并发症,降低死亡率,提高患者生存质量和长期无病生存率。 吴茱萸是吴茱萸芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth.石虎E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang和疏毛吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang干燥的近成熟果实。吴茱萸含有多种化学成分,其中的吴茱萸碱不仅有消炎镇痛、抗氧化、减肥、舒张支气管等作用,还有抗多种肿瘤的作用,如:肺癌细胞、结直肠癌细胞、甲状腺癌细胞、黑色素瘤细胞、前列腺癌细胞、子宫颈癌细胞、纤维瘤细胞、乳腺癌细胞(包括多耐药肿瘤)、人急性髓系白血病细胞U937细胞等。研究表明吴茱萸碱抑制肿瘤细胞的迁移、对耐药肿瘤细胞亦有作用,而且对正常外周血单个核细胞无明显影响。 研究发现caspase-3、NF-KB、MAPK、AKT、AIF、Bcl-2、Bax等信号分子可能参与了吴茱萸碱诱导肿瘤细胞的凋亡过程。本研究观察吴茱萸碱对人白血病细胞株K562细胞、Jurkat细胞、Raji细胞的作用,探讨吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡及其机制,为吴茱萸碱的临床应用提供实验依据。 实验方法 第一部分吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡的研究 1.用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测对照组及不同浓度(2.5、5、10、20、40、80μmol/L)吴茱萸碱作用后24、48、72h白血病细胞株K562细胞、Jurkat细胞、Raji细胞的生长抑制作用; 2.设置对照组及2.5、5、10μmol/L药物组,甲基纤维素半固体培养法培养三种细胞克隆形成,用倒置显微镜检测吴茱萸碱作用前后三种细胞克隆形成率的变化; 3.用倒置显微镜及荧光显微镜Hochest33342染色观察15 umol/L吴茱萸碱作用白血病细胞24小时形态学变化; 4.分别设对照组及5、10、25μmol/L浓度药物组,采用流式细胞仪检测不同浓度吴茱萸碱作用三种细胞后凋亡率变化; 5.分别设对照组及5、10、25μmol/L药物组,采用流式细胞仪检测吴茱萸碱作用三种细胞后细胞周期的变化; 6.分别设对照组及5、10、25μmol/L药物组,采用流式细胞仪检测吴茱萸碱作用三种细胞后细胞内活性氧ROS水平的变化。 第二部分吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡机制的研究 采用免疫印记(Western blotting)技术检测不同浓度Evo作用后的白血病细胞线粒体凋亡途径中关键的信号分子蛋白水平变化:Procapase-3, cleaved-caspase-3, Procapase-9, cleaved-caspase-9, PARP, cleaved-PARP, Bax, Bcl-2。 统计学方法 实验资料结果用均数±标准差(x±s)表示,显著性标准为P0.05,采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。三组细胞比较采用析因设计,组间两两显著性比较采用SNK法,浓度与抑制率关系以及浓度与蛋白表达关系采用相关分析,组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA) o 结果 第一部分吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡的研究 1.吴茱萸碱对白血病细胞的生长抑制作用 CCK-8结果显示,2.5、5、10、20、40、80μmol/L吴茱萸碱Evo对三种细胞均有生长抑制作用,不同浓度Evo作用于K562、Jurkat、Raji细胞,抑制率不同(F=206.691,P0.001;F=219.711,P0.001;F=287.341,P0.001),随着药物浓度的增加,三种细胞的抑制率也增加(P0.05)。24h、48h、72h三个时间点,三种细胞之间抑制率均存在差异(F=198.311,P0.001),SNK两两比较发现K562细胞抑制率显著高于Jurkat细胞抑制率,Jurkat细胞抑制率显著高于Raji细胞抑制率(P0.05)。24h、48h、72h三个时间点之间抑制率有差异(F=164.902,P0.001),随着时间延长抑制率增加(P0.05)。 2.吴茱萸碱对三种白血病细胞株作用对体外克隆形成的影响 细胞在第7、14天分别观察克隆生长情况,对照组细胞第7天就有克隆形成,第14天克隆生长几乎连成片,2.5、5、10μmol/L吴茱萸碱分别作用K562、Jurkat.Raji细胞后,均无克隆形成。 3.吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡 (1)吴茱萸碱作用三种细胞后形态学变化 倒置显微镜观察对照组细胞胞体呈圆形,透亮,大小均匀,胞核较圆,位于细胞中央,15μmol/L吴茱萸碱作用三种细胞24小时后可见培养瓶中较多细胞碎片,尚生存细胞胞体较细长,且尾部呈凸起状,胞体附近可见较小圆形的凋亡小体,细胞透光性差。 (2)荧光显微镜观察 15μmol/L吴茱萸碱作用三种细胞24小时后,荧光显微镜观察药物作用前后细胞形态改变,与对照组三种细胞相比,15μmol/L吴茱萸碱作用后部分细胞出现细胞核固缩,边集,出现凋亡小体。 (3)吴茱萸碱作用三种细胞株凋亡率的变化 流式细胞仪检测结果显示,5、10、25μmol/L浓度吴茱萸碱分别作用于K562、Jurkat.Raji细胞,凋亡率不同,同一浓度下不同细胞的凋亡率也不同,具有统计学意义(早期凋亡F=25.672,P=0.000;晚期凋亡F=10.611,P0.001);单个细胞而言,三个细胞早期凋亡及晚期凋亡率均呈浓度依赖性(P0.001);三个细胞的凋亡率之间比较来看,SNK两两比较显示早期凋亡率无统计学差异(5μmol/L,F=4.686,P=0.059;10μmol/L,F=1.393,P=0.318;25μmol/L,F=1.373,P=0.323),晚期凋亡K562细胞凋亡率高于其他两种细胞,有统计学意义(P0.05)。 (4)吴茱萸碱对细胞周期的影响 流式细胞仪检测细胞周期,结果示:3种细胞比较G0/G1、G2/M期的分布比例无统计学意义(F=1.029;0.574,P=0.431;0.747)。对照组的50%左右细胞处于S期,G0、G1期次之,G2/M期最少。不同浓度Evo处理K562细胞,处于G0/G1、G2/M期的细胞比例不同(F=17.877,P0.001;F=738.451,P0.001),SNK法进行组间两两比较发现低浓度5、10μmol/L Evo作用后的K562细胞与对照组相比处于G2/M期细胞的比例无差异,25μmol/L时差异较显著(P0.05)。不同浓度Evo处理Jurkat细胞,处于G0/G1、G2/M期的细胞比例不同(F=1893.323,P0.001;F=32.902,P0.001),SNK法进行组间两两比较发现在5μmol/L浓度时处于G2/M期的细胞与对照组无差异,10、25μmol/L浓度时处于G2/M期的细胞比例明显增加,且25μmol/L浓度较10μmol/L浓度时高(P0.05)。不同浓度Evo处理Raji细胞,处于G0/G1、G2/M期的细胞比例不同(F=2065.452,P0.001;F=8.149,P0.001),SNK法进行组间两两比较发现5、10μmol/L浓度时,分布于G2/M期的细胞比例与对照组无差异,25μmol/L时与对照组比较明显差异(P'0.05)。 (5)吴茱萸碱对细胞内活性氧(ROS)水平的影响 流式细胞仪检测结果示:不同细胞ROS水平不同,不同浓度下细胞ROS水平也不同(F=20.223,P0.001)。对照组三种细胞比较来看,ROS水平存在差异(F=38.113,P0.001),SNK两两比较发现Jurkat细胞内ROS水平显著高于对照组K562细胞,K562细胞内ROS水平显著高于Raji细胞(P0.05),10μmol/L浓度Evo作用三种细胞ROS水平上升开始出现差异(F=34.722,P=0.001),Jurkat细胞ROS水平上升并不显著,K562细胞胞内ROS水平升高趋势最为显著(P0.05),随着药物浓度的增加,ROS水平增加(P0.05)。 第二部分吴茱萸碱诱导白血病细胞凋亡机制的研究 Evo作用后的白血病细胞线粒体凋亡途径中关键的信号分子蛋白水平变化:Procapase-3, cleaved-caspase-3, Procapase-9, cleaved-caspase-9, PARP, cleaved-PARP, Bax, Bcl-2。 1.caspase家族 (1)不同浓度Evo作用K62细胞,caspase-3蛋白前体条带表达随着药物浓度的增加表达逐渐下降(r=-0.834,P0.001),活化后caspase-3呈上升趋势(r=0.806,P0.001);caspase-9蛋白前体随着药物浓度的增加条带表达有逐渐下降趋势(r=-0.623,P=0.006),活化后caspase-9表达与药物浓度呈正相关(r=0.641,P=0.004)。 (2)不同药物浓度作用Jurkat细胞,caspase-3蛋白前体条带表达随着药物浓度的增加表达逐渐下降(r=-0.738,P0.001),活化后caspase-3呈上升趋势(r=0.822,P0.001);caspase-9蛋白前体随着药物浓度的增加条带表达有逐渐下降趋势(r=-0.835,P0.001),活化后caspase-9表达与药物浓度呈正相关(r=0.897,P0.001)。 (3)不同药物浓度作用Raji细胞,caspase-3蛋白前体条带表达随着药物浓度的增加表达逐渐下降(r=-0.913,P0.001),活化后caspase-3呈上升趋势(r=0.767,P0.001):caspase-9蛋白前体随着药物浓度的增加条带表达有逐渐下降趋势(r=-0.948,P=0.006),活化后caspase-9表达与药物浓度呈正相关(r=0.855,P0.001)。 2.Bcl-2家族 (1)吴茱萸碱作用K562细胞后,Bcl-2家族蛋白表达结果示:随着药物浓度的增加,促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加(r=0.929,P0.001);抗凋亡蛋白Bcl-2的表达逐渐降低(r=-0.902,P0.001);底物PARP的活化水平也逐渐增加(r=0.719,P0.001)。 (2)吴茱萸碱作用Jurkat细胞后,Bcl-2家族蛋白表达结果示:随着药物浓度的增加,促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加(r=0.666,P=0.003);抗凋亡蛋白Bcl-2的表达逐渐降低(r=-0.675,P=0.002);底物PARP的活化水平也逐渐增加(r=0.802,P0.001)。 (3)吴茱萸碱作用Raji细胞后,Bcl-2家族蛋白表达结果示:随着药物浓度的增加,促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加(r=0.932,P0.001);抗凋亡蛋白Bcl-2的表达逐渐降低(r=-0.924,P0.001);底物PARP的活化水平也逐渐增加(r=0.809,P=0.001)。 结论 1、吴茱萸碱对人白血病细胞株K562、Jurkat和Raji细胞有增殖抑制作用,呈时间-剂量依赖性。对K562细胞的增殖抑制作用强于其他两种细胞。 2、对照组有克隆形成,药物作用后无克隆形成。3、对照组细胞胞体呈圆形,透亮,大小均匀,胞核较圆,位于细胞中央;15μmol/L吴茱萸碱作用后细胞透光性差,细胞胞体变细长,Hochest33342可见凋亡小体。 4、吴茱萸碱可诱导人白血病细胞株K562、Jurkat和Raji细胞凋亡。K562细胞凋亡率高于其余两种细胞。 5、吴茱萸碱阻滞白血病细胞的细胞周期在G2/M期。三个细胞无差异。 6、吴茱萸碱作用白血病细胞影响细胞内活性氧(ROS)水平。K562细胞的ROS水平高于Jurkat和Raji细胞。 7、吴茱萸碱作用于K562、Jurkat和Raji细胞,活化并上调caspase-3,caspase-9水平,上调Bax,下调Bcl-2蛋白的表达。


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