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银杏酮酯磷脂复合物的制备及体外初步评价

赖乐  
【摘要】:研究背景和目的 磷脂复合物(phytosome或phospholipid complex)系指在非质子传递体系溶剂中,药物与磷脂以一定配比关系结合而形成的复合。由于磷脂分子的两亲性使其不仅是非常有效的乳化剂,更是细胞膜的重要组成部分。磷脂复合物具有能够穿透表皮屏障,产生强大而持久的药效作用;改善某些药物在胃肠道内的吸收,使药物的生物利用度显著提高;延缓释药,降低体内消除速度。 银杏酮酯(GBE50)为是从银杏叶中提取、精制而成的经国家药品监督管理局批准正式生产的二类中药新药,其主要成分为黄酮醇苷与萜类内酯,其中黄酮酮苷主要有槲皮素苷、山柰酚苷及双黄酮类化合物,具有清除自由基,清除超氧阴离子自由基等自由基、抗氧自由基损伤及抗脂质过氧化损伤的作用,并具有明显降血脂、降胆固醇作用,增加冠状动脉血液流量,减少心肌耗氧,改善微循环,临床主要用于是预防和治疗心脑血管疾病,但是由于其口服吸收差,生物利用度不高,影响临床效果,本研究将银杏酮酯制备成银杏酮酯磷脂复合物,希望能改善银杏酮酯的溶解性能,提高肠透过能力,促进吸收,为提高生物利用度提供有利依据。主要内容 磷脂复合物的制备工艺评价指标一般采用药物与磷脂的结合百分率,磷脂的组成与质量、反应溶剂的选择、药物与磷脂的投料比、反应时间、反应温度、反应物浓度等因素都会影响药物的结合率,本文选用大豆磷脂与GBE50制备复合物后采用高效液相法测定复合物的黄酮醇苷的含量与参与反应原料中的GBE50中的黄酮醇苷的比值计算出结合率,以黄酮醇苷结合率为指标进行单因素实验分别考察反应溶剂、反应时间、反应温度、反应物质量浓度和GBE50与大豆磷脂的投料比例对制备工艺的影响。 对制备工艺进行单因素考察,结果四氢呋喃为最佳反应溶剂,最适反应时间为6h,反应温度为40℃,反应物质量浓度为20mg/ml, GBE50与磷脂的投料比为1:2。 根据单因素实验结果,对GBE50与磷脂的投料比、反应物质量浓度和反应温度进行正交实验,正交实验结果选出最佳的反应条件为:GBE50与磷脂的投料比1:1,反应物质量浓度为20mg/ml,反应温度为30℃。 GBE50磷脂复合物的制备工艺为:称取一定量大豆磷脂加入反应溶剂四氢呋喃,再加入GBE50粉末,设定温度30℃,在恒温磁力搅拌器下搅拌反应6h后,过滤,真空去除反应溶剂,再用惰性溶剂二氯甲烷洗涤没有反应的GBE50原料,最后真空干燥,得GBE50磷脂复合物。 制备的磷脂复合物选用差示扫描量热法(DSC)、红外分光光度法对磷脂复合物进行鉴定,GBE50磷脂复合物的DSC曲线中,药物峰和磷脂峰都消失,且GBE50磷脂复合物的相变温度比磷脂要低,这可能是由于GBE50与磷脂的极性端结合后,磷脂的碳氢链可自由转动,包裹了磷脂的极性部分,使磷脂脂肪烃链间的有序性降低的缘故,使得磷脂的第2个吸热峰也消失。GBE50和磷脂的物理混合物DSC曲线中,也出现了跟GBE50磷脂复合物差不多的峰,这可能是因为样品在受热过程中,磷脂受热融化,与GBE50发生一定的相互作用,因此要进行红外分光光度法进一步鉴定是否形成GBE50磷脂复合物。在红外图谱中在3500-2800 cm-1之间,-OH缔合氢键宽锋形成明显变成尖锐的窄锋,表明GBE50与磷脂间形成了大量的氢键,而物理混合物中则没有这一改变,而磷脂复合物中保留的磷脂中1735、1064 cm-1锋形和宽度发生了一定的改变,这说明磷脂的结构受到GBE50的影响。磷脂复合物中还保留的GBE50的主要特征锋也发生了一定的改变,其中1782、1514 cm-1强度减弱,631 cm-1消失,说明GBE50的结构官能团与大豆磷脂的某些部位发生了相互作用。红外光谱分析表明磷脂复合物中GBE50与大豆磷脂的基本化学结构没有发生根本的改变,而是相互作用形成一个磷脂复合物。 GBE50磷脂复合物的表观油水分配系数比GBE50原料有所增加,其中在水介质中是GBE50的1.6倍,在0.1mol/L盐酸介质中是1.3倍,在PBS液中是2.3倍,而一般而言,具有较大油水分配系数的药物更容易穿透细胞膜转运和吸收,这就为制备成磷脂复合物能提高生物体内的吸收提供了可能性。 采用反向高效液相法对GBE50磷脂复合物中的黄酮醇苷进行含量测定,以甲醇-0.5%磷酸(54:46)为流动相;流速为1ml/min;检测波长为368nm,以槲皮素、山柰素、异鼠李素为对照品,结果槲皮素的标准曲线为:y=9E+07x+19403(R2=0.9996),线性范围:0.00350 mg/ml~0.11200 mg/ml,平均回收率为99.39%,RSD为0.95%;山柰素的标准曲线为:y=1E+08x+12672(R2=0.9996),线性范围:0.00160 mg/ml~0.05120 mg/ml,平均回收率为99.71%,RSD为0.76%;异鼠李素的标准曲线为:y=7E+07X.1046.3(R2=0.9997),线性范围:0.00025mg/ml~0.00800 mg/ml,平均回收率为99.20%,RSD为0.69%。实验测定GBE50磷脂复合物制剂中总黄酮醇苷的含量为11.54%。 体外扩散池(Ussing chamber)法初步评价GBE50-磷脂复合物透过性能,以反向高效液相法测定的肠粘膜透过的黄酮醇苷的量为指标,计算累计透过量和表观渗透系数(Papp),从十二指肠、空肠、回肠、结肠中先选取出最佳区段肠,再对GBE50磷脂复合物、GBE50原料、阳性对照(杏灵颗粒)三组进行比较。结果表明空肠为最佳区段肠,且GBE50磷脂复合物在空肠的表观渗透系数是银杏酮酯原料的1.96倍,是阳性对照(杏灵颗粒)表观渗透系数的1.5倍,表明相比其他两组,磷脂复合物的透过性能都比较好,差异均具有显著性(P0.01),这为制备成GBE50磷脂复合物能提高体内生物利用度进一步提供了可能性。 初步评价GBE50磷脂复合物抑制心肌过氧化实验中,选用过氧化氢诱导损伤的心肌细胞,通过MTT实验和测定细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)比较GBE50磷脂复合物、GBE50原料、阳性对照(杏灵颗粒)。结果H2O2作用2h后心肌细胞MTT产物的A490nm值为0.221±0.010明显低于正常对照组MTT产物的A490nm值0.494±0.023,模型组的心肌细胞存活力明显下降,差异具有统计学意义(P0.001);GBE50磷脂复合物的高、中、低浓度组心肌细胞MTT产物的A490nm值,随着浓度的增大,代表心肌细胞存活力的OD值也升高,呈一定的浓度梯度关系;而阳性对照组与GBE50的中浓度组差异无统计学意义(P=0.544),但是GBE50的中浓度组(3.63μg/ml)比阳性对照组(4.2μg/ml)浓度较低,可能原因磷脂对GBE50有一定的辅助作用。H202损伤模型对照组LDH的活性值为84±2.64 U/L,较正常对照组(56.7±1.53 U/L)明显提高,差异具有统计学意义(P0.001);GBE50磷脂复合物组的低浓度组(2.1μg/ml)与原料药组(3.63μg/ml)差异无统计学意义,而GBE50磷脂复合物的中浓度组(3.63μg/ml)与阳性对照组(4.2μg/ml)差异无统计学意义,但浓度较低,因此结果表明GBE50制备成磷脂复合物后对过氧化氢诱导损伤的心肌细胞的保护作用较原料药和阳性对照组较强。


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