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CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究

汪兵  
【摘要】:[目的] 1、建立DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记方法,并观察99mTc标记物在体内、外的稳定性及其在正常小鼠体内的分布。 2、评价生物素化CD45单抗及99mTc标记生物素在人Raji细胞移植瘤裸鼠模型中三步法预定位放免显像价值。 [材料与方法] 1DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究 1.1实验动物 4-6周龄昆明种小白鼠24只(雌雄不限),质量19-21g,由南方医科大学实验动物中心提供。 1.299mTc标记DTPA-生物素 99mTc标记DTPA-生物素采用直接标记法,纸层析法测定其标记率,固定相为新华1号虑纸,展开剂为丙酮和生理盐水,分别在标记后Oh、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定放化纯度。 1.399mTc标记hIgG 99mTc标记hIgG采用巯基乙醇直接还原法,纸层析法测定其标记率,固定相为新华1号滤纸,展开剂为30%氨水:乙醇:水(1:2:5)和生理盐水,分别在标记后0h、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定标记率及放化纯度。 1.499mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的体外稳定性实验 分别取500μl的99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG溶液,加入1m1的生理盐水(NS)中,放置37℃温育箱中温育至12h,分别于1h、3h、6h、12h取样,用纸层析法测定放化纯度。 1.599mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG在正常小鼠体内的生物分布及显像 取24只昆明种小白鼠,随机分为2组,每组12只小鼠,第一组为静脉注射99mTc-DTPA-生物素组,第二组为静脉注射99mTc-hIgG组。每组于尾静脉注射7.4MBq/100μl的99mTc标记物后1h、3h、6h和12h各取3只小鼠分别进行体外SPECT显像,于显像后断颈处死,取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼及血液,称重后在放射免疫γ计数器中测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的每克组织百分注射剂量率(%ID/g) 2CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究 2.1Raji细胞株 Raji细胞株由南方医科大学南方医院血液科提供。用RPMI1640培养液培养,加入10%胎牛血清,在37℃和5%CO2和95%相对湿度的孵箱内孵育。 2.2流式细胞仪检测Raji细胞CD45表达 收集对数期生长的Raji细胞,PBS洗涤2次,计数细胞,分管,106/管,加入CD45单抗,同型IgG1作为阴性对照抗体,4℃孵育30min,PBS洗涤,用流式细胞仪分析样本中阳性细胞数,计算荧光标记阳性细胞的百分率。 2.3建立淋巴瘤实验动物模型 (1)4-6周龄裸鼠24只(雌雄不限),质量18-22g,由广东省实验动物中心和南方医科大学实验动物中心提供。 (2)收集对数期生长的的Raji淋巴瘤细胞株并离心,生理盐水制成悬浮液(1×108/mL),每只裸鼠双侧臀部皮下注入0.2ml,无特定病原体(SPF级)环境下饲养,待肿瘤细胞种植于裸鼠臀部皮下后,记录肿瘤成瘤时间,成瘤后每2天用游标卡尺测量肿瘤最长径a和最短径b。 2.4生物素化CD45单抗的制备 取2mg CD45单抗,按CD45单抗:生物素酯(摩尔比)=1:30-1:50取样,在O.1M PH8.5碳酸氢钠溶液中反应(1m1),室温下用玻璃棒轻轻搅拌1小时,将反应液注入PD-10层析柱内,放入离心器中(3000转/minx2次)离心层析。 2.5采用HABA/Avidin试剂进行抗体CD45生物素化程度测定 取收集的生物素化CD45单抗100μl,加入900ul的HABA/Avidin试剂中进行反应。由于游离的生物素与HABA/Avidin发生反应约1分钟后,当反应体系的颜色由橙红色转为淡黄色时,测量其500nm的OD值。抗体生物素化程度的计算(根据HABA/Avidin试剂说明书) 2.699mTc标记生物素及99mTc标记CD45单抗 参见标记部分。 2.7淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位体内生物分布测定 取人Raji细胞移植瘤裸鼠12只,每个时间点3只裸鼠,尾静脉注射生物素化CD45单抗100μg/100μL,48h后尾静脉注射亲和素(Avidin)200μg/100μL再过48h尾静脉注射99mTc-DTPA-生物素7.4MBq(20gg/100μl),注药后1h、3h、6h、12h断颈处死裸鼠后,取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼、血液及肿瘤,称重后在γ计数仪中测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的%ID/g及肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值。 2.8淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像 取淋巴瘤荷瘤裸鼠6只,随机分为2组,每组3只。实验组为三步法预定位放免显像组,具体给药时间及方法同上述生物分布实验;对照组为99mTc标记CD45单抗放免显像组,静脉注射99mTc-CD45单抗100μg/100μL,分别于注药后3h、6h、12h进行SPECT显像。上述两组裸鼠于12h的SPECT显像结束后,处死所有裸鼠,分离各脏器,称重并测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的%ID/g和T/NT比值,并进行对比。 2.9统计学分析 全部实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析处理,定量参数(12h的T/B、12h的T/M)用均数±标准差(X±S)表示,两样本比较采用独立样本t检验,P0.05有显著性差异。 [结果] 1DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究 1.199mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的标记率及放化纯度测定 用纸层析法测定99mTc标记DTPA-生物素的标记率80%,99mTc标记hIgG的标记率70%,经PD-10层析柱分离纯化后99mTc-hIgG的放化纯度90%。 1.299mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的体外稳定性测定 99mTc-DTPA-生物素在NS中温育12h均处于较稳定状态,放化纯度均75%;99mTc-hIgG在NS中温育12h均处于稳定状态,放化纯度均85%。 1.399mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG在小鼠体内的SPECT显像 (1)99mTc-DTPA-生物素在注药后1h、3h、6h、12h小鼠SPECT显像结果显示,99mTc-DTPA-生物素在肾内摄取高,提示主要经泌尿系统排泄,血液及肌肉放射性分布较少,影像较淡。 (2)99mTc-hIgG在注药后1h、3h、6h、12h小鼠SPECT显像结果显示,小鼠肝脏和脾脏内见明显放射性聚集,12h内血池见较多放射性分布,而肠道、肌肉、骨骼内放射性分布较少。 2CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究 2.1Raji细胞CD45表达及Raji细胞移植瘤裸鼠模型构建 流式细胞仪测得Raji细胞CD45表达率为78.5%。24只裸鼠有16只成瘤,移植瘤成活率为67%。 2.2生物素化CD45单抗的生物素化程度测定 平均每个CD45单抗结合12个生物素分子 2.399mTc-CD45单抗在淋巴瘤裸鼠模型中的放射免疫显像研究 静脉注射99mTc-CD45单抗后3h、6h、12h荷瘤裸鼠SPECT显像示:肝脏、脾脏及肾脏内见明显放射性聚集,12h血池内见较多放射性分布,12h肿瘤部位见有少量放射性集聚,12h肿瘤的%ID/g为0.89±0.13,肿瘤/血液比值为1.6,肿瘤/肌肉比值达到2.5。 2.4淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像及生物分布研究 三步法给药后1h、3h、6h、12h荷瘤裸鼠SPECT显像示:整个显像期间血池内放射性均较低,肝脏和脾脏内见较多放射性浓聚;注射标记物1h后,移植肿瘤隐约显影,随着时间的延长,肿瘤内放射性浓聚逐渐增多,3-6h肿瘤显影清晰,并持续到12h。注药后3h、6h和12h肿瘤的%ID/g分别为1.73±0.22、1.24±0.03和0.94±0.07;肿瘤/血液比值分别为3.5、4.9和7.8;肿瘤/肌肉比值分别为到8.2、8.9和10.4。 [结论] 199mTc标记DTPA-生物素和IhIgG的标记率分别80%和70%,99mTC标记标记hIgG的放化纯度90%,具有良好的体外稳定性,小鼠体内的生物分布实验表明,99mTc-生物素和99mTc-hIgG在体内的血清除速率及生物学分布明显不同,为进一步的预定位放免显像研究中亲和素-生物素系统的不同组分的选择提供实验数据。 2与99mTc直接标记CD45单抗相比较,99mTc-DTPA-生物素三步法预定位技术在CD45单抗淋巴瘤裸鼠模型放射免疫显像中的应用,显著改善肿瘤的T/NT比值,标记物注射后1h肿瘤即可见显影,3h肿瘤显影清晰,从而达到肿瘤早期显像的目的。上述研究成果为下一步开展CD45单抗三步法预定位放免治疗裸鼠淋巴瘤移植瘤的研究提供实验依据。


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