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IL28B基因多态性与慢性乙型肝炎患者对干扰素应答的关系

陈楚明  
【摘要】:背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染是最严重的,广泛流行的世界健康问题之一,全球受累患者高达20亿。目前世界范围内仍有超过3.5亿的慢性携带者,其中85%生活在亚太地区。感染HBV的人群处于发生肝脏失代偿、肝硬化和肝细胞癌的高风险中。据估计,HBV感染者全球的年病死率为50万~120万。HBV的自然史极为复杂,从自限性感染到慢性感染,从急性肝炎到慢性肝炎,严重者尚可出现肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。在需要进行治疗的感染者中,慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)患者占了大多数。HBV的复制是导致肝损伤和疾病进展的关键。因此,治疗的主要目标是抑制病毒复制直至检测不到病毒DNA,获得HBeAg血清学转换,或者同时达到这两项;以终止或减少肝脏的坏死性炎症;预防肝脏失代偿;长期目标是减少肝硬化和肝细胞癌的发生,最终延长存活期。在除外其他干扰因素的情况下,ALT水平持续超过正常上限的2倍或有显著的肝脏损伤时应采用药物治疗。 目前抗病毒治疗的药物分两大类:一类是α干扰素(包括普通干扰素和长效干扰素),一类是核苷(酸)类似物。两类药物有不同的作用机制。核苷(酸)类似物直接作用于病毒,在抑制病毒和降低复制方面非常有效。与干扰素相比,核苷(酸)类似物有它的优缺点。首要的问题是,核苷(酸)类似物的治疗时间是不明确的,并可能是维持终身的。核苷(酸)类似物诱导的HBeAg血清转换率与治疗的时间成正比,一旦停止治疗,大多数患者(-80%)将复发,即HBeAg复阳。同时,患者还要面对耐药的风险,一旦发生耐药,意味着起初抗病毒治疗产生的临床和组织学获益均会消失。其优点是安全,高效,且服用方便。干扰素(Interferon, IFN)具有免疫调节作用,可影响宿主的免疫系统。有研究证实在干扰素治疗结束后随访6个月的患者中,HBeAg的血清转换率继续升高,一旦在治疗结束后获得治疗反应,HBeAg血清学转换反应在约70-87%的患者中持续存在。因此,干扰素是慢性乙型肝炎的理想治疗手段。 对于代偿性肝病患者应首选IFN治疗,特别是年轻患者、育龄妇女和ALT值低的患者,因为IFN的治疗周期比较固定、能获得持续性的治疗反应,且具有包括预防肝细胞癌在内的长期效益。然而,在完成4-6个月普通干扰素治疗的HBeAg(+)的CHB患者中,只有25%-33%达到了血清转换。而在完成12或者24个月普通干扰素治疗的HBeAg(-)CHB患者当中,达到生化学应答和病毒学应答的比例为22%-30%。为何只有部分病人能获得治疗应答,这是个有待深入研究的课题。在HBeAg(+)的CHB,预测干扰素良好应答的因素有ALT200U/L, HBV DNA1000pg/mL,女性,活动的肝纤维化等;病毒因素中,D型和C型对干扰素的反应要差于A型和B型。 在宿主遗传背景方面,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)会影响个体对疾病的易感性和对药物治疗的反应,这已经在多种疾病中得到证实。特别在乙型肝炎,MHCⅠ、MHCⅡ、TNF-α、甘露糖相关蛋白等基因的SNPs能影响宿主的免疫系统和抗病毒反应,从而影响疾病的进程(如耐受状态,感染慢性化等)和治疗反应。因此,对SNPs的研究可以发现预测慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗反应的重要因素,从而在预测患者可能无法获得良好应答的情况下,避免不必要的药物不良反应和节省医疗费用。 IL28B (interferon-λ3)主要通过JAK-STAT信号途径,诱导磷酸化,上调干扰素激活相关基因(IFN stimulated genes, ISGs)表达,产生一些抗病毒蛋白,从而发挥抗病毒效应。IL28B被认为是调控对HCV免疫反应的关键免疫分子,其基因上一些单核苷酸多态性位点(SNP),特别是SNPrs12979860和SNP rs8099917,已经证实与HCV的自发清除和治疗反应高度相关。HBV与HCV有相类似的免疫机制,IFN-α和ISGs在宿主抗病毒的反应当中均具有重要作用。上述SNP位点是否能影响HBV的治疗反应,值得进一步研究。 目的:通过研究IL28B基因主要SNP (rs12979860和rs8099917)在接受干扰素治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者中的分布规律,阐明IL28B及其基因与干扰素治疗应答的关系,在遗传背景方面寻找影响干扰素疗效的预测因素,为慢性乙型肝炎的个体化治疗提供参考依据,并为深入研究干扰素治疗作用的确切机制提供线索。 方法:采集入组的82例应用干扰素治疗的患者的外周血(38例对干扰素应答,44例对干扰素不应答)。从外周血中提取全基因组DNA,并扩增IL28B基因。SNP rs8099917用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RLFP法)进行基因分型,SNP rs12979860通过直接测序进行基因分型。PCR-RLFP法是基于PCR原理和核酸特异性酶切反应原理的一种SNP基因分型方法。具有具有简单,快速,经济,准确性高等优点。限制性内切酶是分子生物学中研究基因变异的一把手术刀,可以特异性切割所识别的碱基序列,利用这个特点,可以检测基因片段中某一位点是否存在变异,即可对某SNP进行基因分型。IL28B基因SNP rs8099917对应BsrDl的限制性内切酶的酶切位点,当该位点碱基为G时,存在此内切酶的酶切位点,而当G变异为T后此酶切位点消失,因此,酶切后有3种情况:一是酶切后PCR产物长度无变化,电泳图谱仅出现1条带,说明此扩增片段无此酶的酶切位点即为TT基因型;二是杂合型,即一条染色体上有此酶的切点,而另一条染色体上的等位基因没有此酶切位点,电泳图谱出现3条带,即为CG基因型;三是PCR产物被完全切开,电泳图谱仅出现2条带,说明两条染色体均有此酶的切点,为纯合型,即为GG基因型。在对SNP rs8099917进行基因分型时,随机挑选部分样本进行直接测序以证实PCR-RLFP法结果的可靠性。扩增各病例血清中的HBV DNA,扩增产物直接测序进行基因分型。对分型结果进行统计学分析。 结果:82例应用干扰素治疗的HBeAg阳性慢乙肝患者的IL28B基因片段均成功扩增。对SNP rs8099917进行分型时,其PCR-RLFP结果清晰,并能被直接测序的结果加以证实;而对SNP rs12979860进行时,所有片段均直接测序成功。全部病例HBV DNA均成功扩增并成功分型。在干扰素治疗应答组和非应答组,两者间的基因型均只有B型和C型,构成比在两组间无统计学差异。在干扰素治疗应答组,SNP rs8099917基因型TT, TG+GG的比例分别是81.6%(31/38)和18.4%(7/38),等位基因G和T的基因频率是9.2%(7/76)和90.8%(69/76),在干扰素治疗非应答组,SNP rs8099917基因型TT. TG+GG的比例分别是97.7%(43/44),2.3%(1/44),等位基因G和T的基因频率分别是1.1%(1/88)和98.9%(87/88),两组间的差异有统计学意义(基因型P=0.014;基因频率P=0.025)。SNP rs12979860位点等位基因C和T的基因频率在在应答组分别为92.1%(70/76)和7.9%(6/76),在非应答组为97.7%(86/88)和2.3%(2/88),基因型TT+CT和CC的比例在应答组分别为15.8%(6/38)和84.2%(32/38),在非应答组为4.5%(2/44)和95.5%(42/44)。基因频率和基因型频率在干扰素治疗应答组和非应答组均无统计学差异(P0.05)。 结论:(1)IL28B基因SNP rs8099917的CG+GG基因型频率和等位基因G的频率在应答组和非应答组之间存在统计学差异(见表)。提示G等位基因可能与慢性乙型肝炎患者对干扰素治疗的有效应答相关,提示该SNP位点可能通过影响IL28B的表达,后者作用于宿主对HBV的免疫反应,进而影响对干扰素应答的个体反应。(2)IL28B是影响HCV自然清楚和治疗反应的关键免疫分子,但目前尚不清楚IL28B基因如何影响HCV的预后。尽管HBV有和HCV相近似的免疫机制,比如一样对干扰素治疗有反应,IL28B在两者中的机制是否一样,尚需进一步探讨。(3)rs8099917可望成为抗病毒治疗中病例选择和疗效预测的遗传学标志。本研究是一个初步的探讨性研究,下一步可通过扩大样本量来验证其预测作用的大小。(4) SNP rs12979860的基因型频率和基因频率在干扰素治疗应答组和非应答组之间并未观察到有意义的统计学差异。目前尚不能否定其意义,因rs12979860位点和rs8099917位点之间存在连锁不平衡,扩大观察样本量,或许可进一步证实其所起的作用。(5)鉴于rs8099917与两种最常见慢性病毒性肝病的相关性,及其已经被证实的在HCV中的关键作用,rs8099917的分型在相关临床和实验研究中变得普遍。本研究建立的对rs8099917分型的PCR-RLFP方法简单,快捷,成本低廉,有较好的实用价值,利于在科研和临床上推广应用。


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