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结核性脑膜炎脑脊液细胞学及易感基因(TLR2 T597C)的研究

石彦杰  
【摘要】:目的 结核性脑膜炎(Tuberculous meningitis,TBM)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染后最严重的形式,它导致20-25%的感染者死亡,并致使生存患者遗留严重的神经系统后遗症。高死亡率、高致残率的原因部分与诊断延误并由此造成治疗延误有关,因此提高TBM的早期诊断水平成为目前TBM诊疗中急需解决的问题之一。而在对TBM病人的统计分析中发现,全世界约1/3人口感染Mtb,10%的感染者出现结核病的临床症状,仅1%发展为TBM,这可能受宿主基因、环境及病原菌因素的影响。 TBM的诊断困难主要归结于1.TBM临床表现不典型;2.目前缺少快速敏感的诊断方法。而延误诊断及治疗是造成TBM患者死亡率高的主要原因。TBM的发病率在生活水平较低、生活环境较差的国家和地区明显较高,而抗酸染色作为诊断TBM的金标准之一,耗时较短,所需设备及试剂廉价,在几种诊断金标准中,不失为一种理想的确诊方法。但是不同实验室报道的阳性率差别较大并且受药物影响较明显,经过5-15天的药物治疗后,阳性率可从52%降低至2%,并且受到CSF量的影响,因此需要通过临床上一些容易获得的CSF细胞学、常规、生化等检查结果预测抗酸阳性的比例,提高TBM的诊断。 对确诊为TBM患者的脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)细胞学观察发现,不同患者CSF细胞学表现不同,同一患者不同时期的表现亦不同,推测可能和患者的易感性有关。加拿大McGill大学健康中心调查发现,全世界约有20亿人感染Mtb,但最终发病者不到10%,而TBM仅占其中极小一部分,这些结果充分说明了某些个体对TBM存在易感性。目前对双胞胎的研究,对患有先天性免疫缺陷疾病儿童的研究以及全基因组扫描筛选易感基因和候选基因的研究均表明,宿主的基因强烈影响结核病的易感性。在肺外结核病人中,免疫反应基因的改变例如肿瘤坏死因子a (Tumor necrosis factor-a, TNF-a)[9]、Toll样受体2(Toll-like receptors2, TLR2)[1]、P2X7[10],可能部分解释了Mtb更容易由肺部扩散到其他组织例如脑的原因。目前有研究报道在越南人群中Toll样受体2(Toll-like receptors2, TLR2)基因的T597C多态性位点与TBM的易感性相关,但经过维普期刊数据库、PubMed、ScienceDirect等多个数据库检索发现,尚无在中国南方汉族人群中与TBM易感相关性的研究报道。 本实验拟通过CSF细胞学、常规、生化等检测结果,寻找出对TBM患者CSF抗酸染色阳性有提示价值的指标,从而预测抗酸染色阳性的比例,为提高TBM早期诊断水平寻求常规解决途径。同时通过病例对照研究,揭示TLR2T597C基因多态性与中国南方汉族人群TBM易感性的关系,为进一步的疾病相关性和遗传进化研究提供重要的基础数据。 方法 选取南方医院2009年9月至2011年7月疑诊TBM并进行CSF检查的334例标本,根据2010国际TBM协作组制定的诊断标准,选择符合确诊标准患者的83例CSF标本,去除合并恶性肿瘤、HIV感染、自身免疫系统疾病患者的28例CSF标本,去除常规检测项目缺项18例CSF标本,去除PCR阳性的7例CSF标本,剩余CSF标本30例纳入研究,分为两组,即抗酸染色阳性组(10例)和抗酸染色阴性组(20例)。易感基因研究中分TBM组、肺结核组及正常对照组。其中TBM组为2009年9月至2011年5月就诊于南方医院神经内科符合2010年国际TBM协作组确诊标准的患者;肺结核组为2011年12月广州市胸科医院收治的肺结核患者。肺结核病人纳入标准:临床和影像学未发现有肺外结核证据,且痰检抗酸杆菌(涂片或培养)呈阳性;正常对照组为20例汉族无亲缘关系的健康人。所有纳入的研究对象均为中国南方汉族人,均排除恶性肿瘤、HIV感染及自身免疫性疾病。所有采血及CSF对象均签署知情同意书。 细胞学研究中收集的CSFl管(2mL)送往南方医院检验科进行常规、生化检查及病原学检查(培养、抗酸染色及PCR),1管(2mL)送往神经内科实验室进行CSF细胞学检查(MGG染色)及Ziehl-Neelsen抗酸染色。易感基因研究中采集入组患者外周静脉血(使用EDTA抗凝管)或CSF,采集标本后无菌条件下迅速分装于冻存管后置于液氮中,冻结后转移到一80℃冰箱中保存,统一提取基因组DNA。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN,51104, USA)提取基因组DNA。根据GenBank公布的人类TLR2基因信息(rs3804099),用Oligo6.0及primer premier5.0软件设计引物,对TLR2基因编码区翻译起始部位进行PCR扩增,扩增的上游引物为:5'-TTTTCTTCCCTGGGCAGTC-3';下游引物为:5'-TCGCAGTTCCAAACATTCC-3'。PCR扩增产物大小为400bp。将PCR产物送往华大基因测序。对照参考序列,在BLAST数据库中对比测序结果获得TLR2基因多态性位点的信息。 使用SPSS13.0统计软件进行数据处理。CSF细胞学研究中采用独立样本t检验法筛选抗酸染色阳性的可能影响因素,采用Logistic回归法分析抗酸染色阳性的影响因素,采用Roc曲线建立预测值的界值;易感基因研究中采用t检验对计量资料进行描述,采用x2检验对组间等位基因和基因型频率进行比较。对正常对照组基因分布进行Hardy-Weinberg平衡检测,P0.05为差异具有统计学意义。 结果 独立样本t检验发现在CSF白细胞数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、浆细胞百分比、CSF蛋白、CSF糖/血糖比值、CSF氯化物、CSF腺苷脱氨酶、腰穿压力中,仅有淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、浆细胞百分比、CSF糖/血糖比在抗酸阳性组和阴性组间有统计学差异。采用Logistic回归方法对筛选出的有意义指标进行统计分析发现,只有中性粒细胞百分比、浆细胞百分比及CSF糖/血糖比值进入回归方程。ROC曲线结果依此表明:中性粒细胞百分比≥37.5%,抗酸染色呈阳性的敏感性80%,特异性65%;浆细胞百分比≥2.5%,敏感性80%,特异性85%;CSF糖/血糖比≤0.285,敏感性70%,特异性80%;回归方程logit(P)=β0+β1x1+β2x2+...+βpxp中,P值≥0.3977654,敏感性80%,特异性90%。 易感基因研究中包含9例TBM组病人,20例肺结核组病人及20例健康对照。TBM组平均年龄为32.7±12.1岁,男2例,女7例。肺结核组平均年龄为38.3±14.8岁,健康对照组平均年龄为25.0±2.4岁,两组中男女均为10例。TBM及肺结核组年龄上无显著性差异。对照组经Hardy-Weinberg平衡检测显示来自遗传平衡群体。由于样本数较少,597CC基因型出现的频率较低,故将597TC,597CC基因型合称为变异基因型。变异基因型在对照组、肺结核组及TBM组中的频率分别为55%(11/20),65%(13/20),89%(8/9),在三组间无显著性差异(χ2=3.560,P=0.169),在对照组与结核病组(包括肺结核组及TBM组)间亦无统计学差异(χ2=1.584,P=0.208,OR=2.15,95%CI:0.65~7.13)。597C等位基因在对照组、肺结核组及TBM组中的频率分别为30%(12/40),38%(15/40),61%(11/18),三组间无显著性差异(χ2=5.108,P=0.078),在对照组与结核病组间亦无统计学差异(χ2=2.192,P=0.139,OR=1.90,95%CI:1.81~4.44)。变异基因型及597C等位基因在TBM组中的频率均明显高于对照组,但由于受检验例数所限,检验效能较低(N=49,Power0.5),暂未得出统计学上的差异。 讨论 对CSF细胞学的研究发现,中性粒细胞和浆细胞百分比增高、CSF糖/血糖比值降低与CSF抗酸染色阳性率有关。可通过CSF细胞学、常规、生化等检验结果预测抗酸染色阳性率,提高临床医生对TBM诊断的预测性。但是由于标本例数有限,有些可能与抗酸阳性有关的指标尚未得出统计学上的差异,例如CSF淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比,需要增加样本量进一步分析。而对确诊的TBM患者CSF细胞学的动态观察发现,同一患者不同时期表现不同,提示在TBM不同疾病进程有多种不同的炎症基因参与。我们假设这些基因的改变与CSF细胞学表现以及人群对TBM的易感性存在着因果关系,并且其中一部分属于TBM的炎症易感基因。 因此,我们检索了既往的研究文献,同时进行了CSF基因芯片的初步筛查,选定TLR2基因作为研究靶点,首次研究了中国南方汉族人群中位于TLR2翻译起始位点的T597C单核苷酸多态性与结核病尤其是TBM的相关性。TLR2基因T597C单核苷酸多态性在不同的种群、地区间的分布具有明显的差异。在本研究中,正常南方汉族人群中597T等位基因出现的频率为70%(28/40),而在正常高加索人群中597T等位基因出现的频率为3%(3/110),然而在越南及日本正常人群中出现的频率分别为75%(564/754),50%(24/48),可见597T等位基因在高加索人群中为次要基因,而在亚洲人群中为常见基因,这些差异可能影响基因的功能。 Thuong等在越南对183例肺结核患者,175例TBM患者与389份新生儿脐带血做对照研究发现,TLR2基因T597C单核苷酸多态性与结核病易感性相关,而将肺结核组和TBM组分别与对照组对比研究发现,T597C与肺结核无关,而与TBM相关,尤其在TBM合并有粟粒性肺结核患者中更显著,并且与TBM的严重程度也相关。同时还发现,TLR2基因T597C位点联合含TLR结构域的蛋白分子基因(TIR domain-containing adapter protein TIRAP)的C558T位点突变增加了TBM的易感性。Caws等在越南人群中也通过对187例TBM患者、237例肺结核患者及389例对照者的研究发现,TLR2基因T597C单核苷酸多态性与TBM易感相关,而与肺结核无关,但这种易感性仅限于在北京菌株引起的TBM中,而其他菌株引起的TBM尚不明确。为研究T597C单核苷酸多态性在中国南方汉族人群中与结核病尤其是TBM的相关性,我们对肺结核组、TBM组以及对照组进行病例对照研究,研究发现在TBM组中变异基因型和597C等位基因的频率明显高于对照组,T597C单核苷酸多态性与结核病尤其是TBM可能存在相关性,与Thuong、Caws等人在越南的研究结果基本一致,但由于受检验例数所限,检验效能较低(0.5),暂未得出统计学上的差异。 总之,我们的研究发现中性粒细胞和浆细胞百分比增高、CSF糖/血糖比值降低对CSF抗酸染色阳性有重要的提示作用,并通过对TBM患者CSF细胞学的动态观察推测基因易感性的存在,但是对易感基因的研究尚不能证明TLR2基因T597C单核苷酸多态性与中国南方汉族人群TBM及肺结核的易感性相关,但变异基因型和597C等位基因的频率在TBM组中明显高于对照组,如果能增加病例数,提高检验效能,可能会发现其与结核病尤其是TBM的易感性相关。由于广州南方医院为省三级甲等医院,就诊TBM患者绝大多数已在当地经过相应治疗,导致CSF病原学检测阳性率降低,入组病例数较少,统计检验效能较低,所反映的信息有限,暂未得出统计学上的差异,有待扩大样本量做更进一步的研究。


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