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维甲酸对大鼠脂肪源干细胞中生殖细胞相关基因及细胞周期的影响

段富华  
【摘要】:背景 原林教授提出的筋膜学两系统理论认为:人体由非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该筋膜支架所包绕的功能系统所构成。支持与储备系统以干细胞为核心,可为功能系统的更新提供细胞补充,并为功能系统的各种功能细胞的更新、代谢提供一个较为稳定内部环境和干细胞源。疏松结缔组织是支持与储备系统重要的组成部分,其中的脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是机体重要的干细胞储备之一。 目前对脂肪源干细胞的研究已取得重大进展。脂肪源干细胞是从脂肪组织中获取的一类具有多向分化潜能的成体干细胞,称之为adipose-derived stem cells (ADSCs)。Zuk等首次从人的脂肪组织悬液中分离出了可以在体外稳定增殖、具有多向分化能力的脂肪组织提取细胞(processed lipoaspirate cells.PLA细胞)。与其他成体干细胞比较,PLA细胞具有来源广泛、取材方便,创伤小且不存在免疫排斥反应等优点,实验证明ADSCs具有跨胚层的多向分化潜能。它可以分化成中胚层来源的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞,外胚层来源的神经细胞,也可以分化成内胚层来源的内皮细胞,及肝细胞等。但脂肪干细胞是否能够向生殖细胞方向分化呢? 生殖细胞(germ cell)是多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称,包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞。人类胚胎发育到第3周末,胚胎产生三个原始胚层(内胚层、中胚层和外胚层)。发育到第4周,胚外外胚层诱导临近的上胚层内产生原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)。迁移入生殖嵴后的PGC,开始了性别的分化。胚胎生殖细胞具有多能性,细胞标记与ES细胞几乎是一致的,碱性磷酸酶染色和Oct4表达均呈阳性,通常用此标记检测小鼠体内组织中特化的PGC。 在胚胎6.25d, Vasa是生殖细胞特异的三磷酸腺(ATP)依赖的RNA解旋酶,Vasa编码的RNA结合蛋白定位于胞质,在生殖嵴区域的PGC中表达,是迁移后期进入性腺的生殖细胞包括生殖母细胞特异性标记基因。、Vasa基因在卵巢和睾丸组织中表达,成体组织中检测不到,是生殖细胞分化的高度特异性标志。到目前为止,Vasa是唯一对于生殖细胞系完全特异的,大多数种属细胞中Vasa表达出现即代表生殖细胞特化。组织非特异碱性磷酸酶(tissue non-specificalkaline phosphatase, TNAP)作为PGC的标志物,可监测PGC由尿囊到生殖嵴的迁移过程。在精子和卵细胞形成过程中,Stra8调节减数分裂起始,减数分裂是通过RA诱导的Stra8实现的。 干细胞体外诱导分化的方法大致有3种:①培养基中添加诱导分化因子,目前使用最多最广泛;②与希望诱导分化的目的细胞共培养;③目的基因转染,使拟诱导分化的细胞表达。本实验是在培养基中添加诱导剂维甲酸和睾酮对脂肪干细胞进行诱导。维甲酸是配子形成的一个基本调节者。人们已经很确定的是,维甲酸是由饮食维生素A合成的,是雌雄配子进入减数分裂所需要的,维生素A的缺乏会导致这个过程的停止。雌鼠的性腺性别被决定后减数分裂很快被发起,由于减数分裂是通过RA诱导的Stra8实现的,这种发起会被RA拮抗物或是敲去Stra8所阻断。Stra8主要在减数分裂前生殖细胞中表达,一旦进入减数分裂,Stra8mRNA水平在生殖细胞中大大降低或消失。睾酮是由睾丸分泌的一种类固醇激素,是人体内主要的雄激素,与男性第二性征的发育有关,在精子发生过程中具有重要作用。 本实验基于筋膜学理论,研究探索脂肪源干细胞是否在体外诱导情况下具有向生殖系分化潜能,即在体外诱导情况下,观察是否能检测出生殖系特异性基因的表达。 目的 MSCs的多组织来源性,与筋膜结缔组织支架的全身分布性具有一致性,其横向、纵向分化的生物学特性,与筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式。本实验采用大鼠筋膜结缔组织皮下脂肪作为组织来源,分离培养ADSCs,并对其表型鉴定,探讨筋膜结缔组织中对机体产生支持储备作用的细胞学基础;研究ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Stra8, Vasa, Oct4, Dazl, Nobox和Piwil,进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能;研究在睾酮和维甲酸单独和联合诱导下,ADSCs细胞周期的变化,进而判断睾酮和维甲酸对细胞周期的影响。 1通过细胞分离培养判断非特异性筋膜结缔组织中是否存在未分化的间充质干细胞,以及这种干细胞的相关特性; 2、通过RT-PCR技术观察ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Stra8和Vasa,进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能; 3、通过定量PCR技术观察ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil及表达量,进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能; 4、探索在睾酮和维甲酸单独和联合诱导下,ADSCs细胞周期的变化,进而判断睾酮和维甲酸对细胞周期的影响。 方法 1、取2月龄SD雌性大鼠腹股沟部皮下脂肪组织,采用酶消化法分离、培养脂肪源干细胞。通过细胞形态学、功能学、流式细胞术鉴定非特异性筋膜结缔组织中的脂肪源干细胞是否符合间充质干细胞的特性以及部分表面标记,以验证非特异性筋膜结缔组织中是否含有间充质干细胞。 2、将第四代ADSCs经成骨诱导和成脂肪诱导分化培养后,分别进行相应的茜素红和油红O染色,以鉴定ADSCs的分化潜能。同时取培养的第四代ADSCs进行流式细胞术检测部分表面抗原,证明ADSCs干细胞特性。 3、取培养的第四代ADSCs的总RNA进行RT-PCR,用微量酶标仪检测原始生殖细胞标记非特异性碱性磷酸酶;分别检测维甲酸诱导前后细胞中Stra8和Sasa的表达,以睾丸细胞中的Stra8和Vasa的表达作阳性对照。 4、取培养的第四代ADSCs分①对照组(不加任何诱导剂),②10-5mol/LRA诱导2周,③10-5mol/LRA诱导4周,④10-6mol/LRA诱导2周,⑤10-6mol/LRA诱导3周,⑥10-6mol/LRA诱导4周,然后分别检测各组中生殖细胞相关基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil的表达。 5、取培养的第四代ADSCs分①对照组(不加任何诱导剂),②10-5mol/LRA组,③10-6mol/LRA组,④10-5mol/LRA+睾酮组,⑤10-6mol/LRA+睾酮组,⑥睾酮组,各组培养36小时后行流式细胞仪检测各细胞分期的变化。 结果 1、光学显微镜下观察贴壁ADSCs形态多呈梭形、多边形,细胞大小均匀; 2、流式细胞术鉴定ADSCs的表面抗原显示CD29、CD90、CD106呈阳性,CDllb、CD45、CD49d呈阴性; 3、ADSCs在成脂诱导培养14天后,油红O染色显示特异性脂滴,而阴性对照孔中未观察到红染的脂滴。成脂诱导培养21天后,茜素红染色显示矿化结节呈特异性的粉红色,阴性对照孔中未见被染成粉红色的钙结节; 4、微量酶标仪检测显示ADSCs经维甲酸诱导后碱性磷酸酶的表达显著增高,将ADSCs分别用10-Smol/L,10-6mol/L,10-7mol/L RA诱导7d的OD值分别为0.585±0.04,0.268±0.07,0.151-0.03,对照组为0.068±0.01,诱导14d的OD值分别为0.417±0.02,0.341±0.01,0.187±0.02,对照组为0.067±0.01,说明RA能显著性促进ADSCs碱性磷酸酶的表达(P0.01)。RT-PCR结果显示ADSCs中RA诱导前和诱导后均不表达stra8和vasa,日性对照组睾丸细胞中可表达生殖细胞标记基因stra8和vasa。 5、定量PCR结果显示,ADSCs经维甲酸诱导后能够表达oct4, dazl, nobox, piwil四个基因,oct4, dazl, nobox的表达规律较为一致,均在10-6mol/L RA诱导3周时表达量最高,piwil在10-6mol/L RA诱导4周时表达量最高。 6、流式细胞术显示,各组G1期的细胞比例分别为80.3%,82.0%,85.2%,81.0%,65.1%,68.5%,各组S期的细胞比例分别为14.7%,12.7%,9.2%,13.5%,28.6%,22.7%。 结论 1、通过本实验笔者认为在发育成熟大鼠的筋膜结缔组织的脂肪中存在多能干细胞,而且可通过消化-贴壁-传代的程序分离得到这些ADSCs;为筋膜结缔组织对机体发挥着支持与储备作用(干细胞储备)提供实验支持,即筋膜结缔组织中的ADSCs为机体损伤修复提供细胞来源。 2、ADSCs具有成体间充质干细胞特性,具有多向分化潜能,经定向诱导培养后可向成骨和成脂分化。 3、ADSCs在维甲酸诱导下能够表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶,但用10-5mol/L维甲酸诱导7d不能表达生殖标记基因Stra8和Vasa,睾丸细胞中表达生殖标记基因Stra8和Vasa。 4、在维甲酸诱导下ADSCs能够表达生殖细胞相关基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil,表明ADSCs生维甲酸诱导下具有向生殖细胞方向分化的潜在能力。 5、维甲酸能够抑制脂肪源干细胞的增殖,睾酮则能够促进脂肪源干细胞的增殖。 综上所述,本研究分别采用了细胞分离培养、流式细胞术,成脂成骨诱导培养及检测等技术手段,从ADSCs形态特征,成脂、成骨诱导、表面标志等方面探讨ADSCs。证实在成熟大鼠的结缔组织中存在间充质干细胞,提示分布于全身的筋膜结缔组织支架很可能就是机体内在的“干细胞库”。这种干细胞易于分离培养,具有良好的增殖、分化能力。笔者认为ADSCs是筋膜中间充质干细胞的一种储备形式,更重要的是筋膜结缔组织对机体的支持与储备起着细胞储备作用,为机体损伤修复提供干细胞支持。 通过微量酶标仪检测,ADSCs在维甲酸诱导下原始生殖细胞标记碱性磷酸酶的表达显著升高,通过RT-qPCT技术检测证实ADSCs用10-5mol/L维甲酸诱导7d不能表达生殖标记基因Stra8和Vasa,在维甲酸诱导下ADSCs能够表达生殖细胞相关基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil,表明ADSCs具有向生殖细胞方向分化的潜能。维甲酸能够抑制ADSCs增殖。


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