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蚊性别决定的分子机制及重组蚊浓核病毒的杀虫效果测试

顾金保  
【摘要】:研究背景:蚊媒传染病是以蚊虫为媒介传播的疾病,包括疟疾、丝虫病、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等。蚊媒病流行范围广,传播力强,发病率高,全球每年有上亿人感染疟疾、登革热等蚊媒病,死亡人数过百万。媒介蚊虫防制是控制蚊媒传染病流行的重要措施。目前,对于登革热、黄热病、西尼罗病毒病等蚊媒性病毒传染病尚无特效治疗方法或特异性预防手段,而疟原虫对传统药物抗药性也逐渐凸显,媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出,而寻求有效的控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。虽然媒介化学防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有统治地位,但是化学农药所造成严重的环境污染,易引起蚊虫药物抗性产生等弊端日益显现,蚊虫的生物防制愈来愈受到人们的青睐。生物防制主要应用蚊虫病原体、寄生物、捕食物来达到防治效果,对非目标生物和有益生物无害,不污染环境,蚊虫对其不易产生抗性。近年,苏云金芽孢杆菌、杆状病毒,虹彩病毒等多种蚊虫病原体相继直接或通过基因工程改造加强其致病性和毒力后应用于蚊虫防制实验中,而近来随着一系列新的蚊类特有病毒蚊浓核病毒(Mosquito densoviruses,MDV)在国内外不断被发现与深入研究,其病原学与分子生物学特征使其具有蚊虫防制的潜在价值以及其它种类病原不能比拟的优势,发展MDV为新型蚊类生物杀虫剂将为蚊媒传染病生物防制提供了一个崭新方向。 MDVs属细小病毒科(Parvovirinae),可特异性感染蚊类的病原,感染蚊类后引起宿主特征性的细胞核致密增生病变(Densonucleosis),严重时导致宿主发病甚至死亡。人们相继从多种实验室蚊细胞系/实验室株以及自然界中的埃及伊蚊、白纹伊蚊、微小按蚊等蚊类中相继分离到该类病毒。 MDVs为单链DNA病毒,基因组长大约4000nt左右,目前多种MDVs的全病毒基因组已克隆入质粒载体,在大肠杆菌中得以扩增,从而简化了病毒的亚克隆改造过程。病毒质粒转化蚊类细胞如C6/36后,表达非结构蛋白可以特异识别病毒基因组两端IRS序列并将基因组从质粒上切割下,进而大量复制与包装,完全恢复野生型性状而达到病毒的自我拯救作用。 MDV的病原学特点吸引人们利用野生病毒作为杀虫剂进行了相关实验并暴露出一些野生病毒的常见问题,例如:杀虫活性低,作用速度慢等。通过基因工程改造病原体使之表达影响昆虫正常生理代谢的酶、激素或作用于昆虫的毒素蛋白则是解决这些问题的有效途径。昆虫特异性神经毒素是一类作用于昆虫神经系统,有毒杀作用的蛋白类神经毒素,由蝎子、蜘蛛、胡蜂、蚂蚁等捕食性动物毒腺分泌的毒液纯化而来。已有多种蝎毒基因在转基因植物中表达并用于害虫防制,在昆虫杆状病毒、绿僵菌等病原体中表达后有效地增加了杀伤效果。 目的:本研究拟以埃及伊蚊浓核病毒(Aedes aegypti densovirus,AeDNV)为载体,表达昆蝎类昆虫特异性神经毒素BmK IT,通过实验室测试重组病毒的杀伤效果,从而为新型蚊类特异性生物杀虫剂的开发奠定基础。 方法:根据已报道的东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素(Buthus martensii Karsch insect toxin,BmK IT)的cDNA序列合成全长cDNA(包括其N端信号肽序列与末尾终止序列)。埃及伊蚊浓核病毒AeDNV全基因组已克隆入载体质粒pUC19构建成质粒pUCA,将蝎毒基因BmK IT克隆到pUCA质粒AeaDNA非结构蛋白启动子p7之后,与非结构蛋白NS1融合表达,从而构建质粒pUCA-AIT。载体pUCA-AIT与pUCA共转染蚊C6/36细胞系。获得重组病毒颗粒后感染白纹伊蚊幼虫,RT-PCR检测蝎毒基因是否在C6/36细胞和白纹伊蚊中转录。Western-blot验证蝎毒基因是否表达。将实验室不同发育阶段的白纹伊蚊幼虫暴露在不同浓度的重组病毒颗粒下,以野生病毒颗粒为对照。于不同时段记录各组幼虫死亡情况,对比评价各种重组病毒的杀虫效果。 结果:RT-PCR与Western-blot结果证实蝎毒基因可在C6/36细胞和白纹伊蚊活体内转录和表达。可表达蝎毒蛋白的重组蚊浓核病毒对白纹伊蚊致死率明显高于野生病毒,其半数致死量LD50低于野生病毒,半数致死时间LT50短于野生型,此外其对蚊虫的亚致死效应也优于野生病毒。 结论:畜安全、高效、选择性强是生物杀虫剂开发的目标,通过基因工程改造的病毒作为生物害虫杀虫剂具有广阔的发展前景。以埃及伊蚊浓核病毒AeaDNV为载体系统,表达蝎类昆虫特异性神经毒素BmK IT有效的强化病毒杀伤效果,为发展重组蚊浓核病毒生物杀虫剂提供了理论基础。


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