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《南方医科大学》 2012年
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钙池操纵性钙内流在人肺腺癌A549细胞中的研究

杨海虹  
【摘要】:研究背景 肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。肺癌中80%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer. NSCLC),病理上以鳞癌、腺癌和大细胞癌为主。因此研究肺癌的发生发展机制,寻找有效的治疗靶点,对于改善NSCLC预后,实施个体化治疗尤为重要。钙离子(Ca2+)作为第二信使,在细胞信号传导通路中起着重要的作用,调控细胞周期、分化、增殖和凋亡。近年来关于钙池操纵性钙通道(SOCC)的研究越来越多,由SOCC介导的钙池操纵性钙内流(SOCE)是非兴奋细胞例如上皮细胞产生Ca2+内流的主要方式。研究发现SOCE信号通路中的SITM1及ORAI1蛋白,由于其在介导SOCE中的作用而受到广泛关注。STIM1主要存在于细胞内质网膜上,在钙池消耗后,它作为一种“钙池信号感受蛋白”感受钙池充盈状态,并聚集成"puncta"向细胞膜移动靠近,而非嵌入到细胞膜中,此后STIM1通过羧基端与细胞膜上的SOCC通道蛋白如ORAI1的相互作用而开放钙通道,形成SOCE。STIM1和oRAI1介导的SOCE对上皮细胞的增殖、分化至关重要,因为多数肿瘤来源于上皮细胞,它们在肿瘤细胞中也陆续有相关的研究报道出现。NSCLC多来源于支气管上皮细胞,因此我们选择人肺腺癌细胞A549,研究SOCE在肺癌细胞中的表达情况;研究STIM1/ORAI1介导的SOCE对肺癌细胞的生物学行为如增殖、迁移和侵袭功能的影响;研究NSCLC患者手术肿瘤组织中STIM1或ORAI1表达和生存预后的关系。 研究目的 首先研究人NSCLC肿瘤组织中的SOCC通道STIM1和ORAI1的mRNA表达情况;其次在人肺腺癌细胞系A549中,研究SOCE与细胞增殖、迁移和侵袭的关系;然后研究STIM1和ORAI1蛋白在A549细胞增殖、迁移和侵袭功能中的作用;最后研究NSCLC患者手术肿瘤组织中STIM1或ORAI1蛋白表达和生存预后的关系。 研究方法 1、我们共收集2007-2009年NSCLC术后肿瘤组织和配对远癌正常肺组织(距肿瘤5cm)24例,标本来自于广州医学院第一附属医院呼吸疾病研究所胸心外科。所有患者术前未行放化疗和其他抗肿瘤治疗。采用Trizol法提取组织总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR方法检测组织STIM1和ORAI1mRNA表达。 2、人肺腺癌A549细胞,人支气管上皮细胞16HBE购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞增殖实验中,A549细胞和16HBE细胞中分别加入SOCE抑制剂SKF-96365或NiCl2。应用罗氏公司WST-1细胞增殖检测试剂盒检测24、48、72h的OD值,细胞增殖抑制率=1-实验组OD值/正常对照组OD值。A549细胞迁移和侵袭实验是应用Transwell小室法,迁移率=细胞迁移总数-上层未迁移细胞数/细胞总数,侵袭时检测迁移到Transwell小室的下室的细胞数。SOCE细胞钙功能测定是应用Fura-2Am荧光素方法检测,InCytIm2软件收集数据和分析。 3、我们设计合成siRNA, Nucleofector细胞核转染方法瞬时沉默STIMIIORAH基因表达,然后检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭功能的改变,余检测方法同上。 4、我们应用S-P免疫组化方法检测70例ⅢA期NSCLC患者手术肿瘤组织STIM1和0RAI1蛋白表达,统计学分析和患者无疾病生存预后的关系。 研究结果 1.NSCLC肿瘤组织中STIM1/ORAI1mRNA的表达 24例患者肿瘤组织STIM1mRNA相对表达量中位值0.84(0.19-3.4),1.09±0.82(X±S);正常组织STIM1mRNA相对表达量中位值0.83(0.33-2.6)0.91±0.51(P0.05)。17例患者肿瘤组织ORAI1mRNA相对表达量中位值0.95(0.31-4.9),1.51±1.46;正常肺组织ORAI1mKNA相对表达量中位值0.76(0.31-4.0),1.0±0.92(P0.05)。在亚组分析中,我们发现腺癌和鳞癌之间的STIM1、ORAI1mKNA的表达无统计学差异(P0.05),但腺癌的STIM1表达有高于鳞癌的趋势(P=0.055);低分化肿瘤组织中ORAI1表达要高于分化较好的肿瘤和正常肺组织(P=0.0280.05),而STIM1却没有类似发现。 2.SOCE对A549肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响 2.1A549和16HBE细胞的SOCE 在含钙PSS溶液灌流后,不同浓度的SKF-96365和NiCl2都可以减少钙内流,并呈浓度依赖性。我们选取8-14个细胞,相对于未处理过的A549细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,482±36nM), SKF-96365处理过的细胞出现△[Ca2+]i下降(P0.001):其中SKF-963651μM (372±17nM);10μM (268±26nM);50μM (188±23nM)。相对于未处理的A549细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,482±36nM), NiCl2处理过的细胞出现△[Ca2+]i下降(P0.001):其中NiCl250μM(268±33nM);200μM (250±55nM);500μM(208±47nM)。 在含钙PSS溶液灌流后,低浓度的SKF-96365增加16HBE细胞钙内流,但高浓度的SKF-96365才减少细胞钙内流。我们选取9-11个细胞,相对于未处理过的16HBE细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,290±53nM),低浓度SKF-96365处理过的细胞出现△[Ca2+]i上升(P0.001):其中SKF-963651μM (743±93nM);10μM (510±32nM),但高浓度SKF-9636550μM处理后细胞钙内流减少(180±29nM)。相对于未处理过的16HBE细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,460±45nM), NiCl2处理过的细胞出现△[Ca2+]i下降(P0.001):其中NiCl2200μM (337±37nM);500μM(173±28nM);1000μM(58±6.1nM)。 2.2SOCE抑制剂处理后的A549和16HBE细胞增殖实验 我们首先选择不同浓度SKF-96365处理A549细胞,48h后观察细胞增殖抑制率,结果显示:SKF-963651μM(33%±5%);10μM(46%±4%);50μM(58%±1%),因此我们选择SKF-9636510μM进行下一步的实验。A549细胞经过SKF-9636510μM处理24h、48h和72h,我们发现不同时间点细胞的增殖受到明显的抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为20%±3%,52%±4%,73%±6%。16HBE细胞经过SKF-9636510μM处理24h、48h和72h,发现不同时间点细胞的增殖受到抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为14%±4%,38%±7%;67%±3%。 我们首先选择不同浓度NiCl2处理A549细胞,48h后观察细胞增殖抑制率,结果显示:NiCl2200μM (44%±3%);500μM (50%±4%);1000μM(64%±10%),因此我们选择NiCl2500μM进行下一步的实验。A549细胞经过NiCl2500μM处理24h、48h和72h,我们发现不同时间点细胞的增殖受到抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为12%±4%,50%±4%,62%±9%。16HBE细胞经过NiCl2500μM处理24h、48h和72h,我们发现不同时间点细胞的增殖受到抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为14%±4%,43%±3%,63%±4%。 2.3SOCE抑制剂处理后的A549细胞的迁移和侵袭 我们在预实验中发现A549细胞有迁移能力,而16HBE细胞无迁移能力。我们发现不同浓度的SKF-96365和NiCl2可以明显抑制A549细胞的迁移。相对于未处理过的A549细胞(迁移率,49%±3%),SKF-96365处理后的A549细胞的迁移率降低:SKF-963651μM(20%±3%);10μM(10%±2%);50μM(8%±2%)(P0.001)。相对于未处理过的A549细胞(迁移率,47%±2%),NiCl250μM (32%±6%);200μM (30%±5%);500μM (19%±4%);1000μM(11%±4%)(P0.001)。实验中,我们还发现低浓度的SKF-963651μM和NiCl250μM都可以明显抑制A549细胞的迁移。 不同浓度的SKF-96365和NiCl2可以明显抑制A549细胞的侵袭。相对于未处理过的A549细胞(6个视野迁移细胞,503±45个),SKF-96365处理后的A549细胞的迁移细胞减少:SKF-963651μM(210±36个);10μM(110±26个);50μM(20±5个)(P0.001)。相对于未处理过的A549细胞(6个视野迁移细胞,503±45个),NiCl2200μM(396±55个);500μM(320±53个);1000μM(100±30个),其中NiCl2500μM和1000μM处理后的迁移细胞相对于未处理组减少(P0.01) 3. STIM1/ORAI1在A549细胞增殖、迁移和侵袭功能中的作用 3.1siRNA瞬时沉默A549细胞STIM1/ORAI1基因表达 我们应用siRNA沉默A549细胞STIM1基因表达,48h基因瞬时沉默效率最高,可达84%,72h蛋白瞬时沉默效率最高,约70%。我们应用siRNA沉默A549细胞ORAI1基因表达,24h基因瞬时沉默效率最高,可达91%,48h蛋白瞬时沉默效率最高,约80%。 3.2A549细胞STIM1/ORAI1基因表达沉默后的SOCE 我们在瞬时干扰后72h进行钙功能的测定。相对于Negative干扰组(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,284±52nM), STIM1干扰组出现了SOCE的下降,约1/3(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,194±28nM)(P0.001)。我们在瞬时干扰后48小时进行钙功能的测定。相对于Negative干扰组(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,145±47nM) ORAI1干扰组出现了SOCE的下降,约1/3(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,92±24nM)(P0.05)。 3.3沉默A549细胞STIM1/ORAI1基因表达后的细胞增殖试验 我们发现siRNA瞬时沉默STIM1表达后,A549细胞增殖功能没有明显改变。STIM1或ORAI1siRNA干扰后A549细胞24-96h生长曲线和Negative干扰组无差异。 3.4沉默A549细胞STIM1/ORAI1基因表达后的细胞迁移和侵袭试验 我们发现siRNA瞬时沉默A549细胞STIM1表达后,72h后我们应用Transwell小室法检测细胞迁移率。相对于Negative组(迁移率,38%±2%)STIM1干扰组(迁移率,14%±4%),因此STIM1干扰组的细胞迁移率有下降(P0.01)。siRNA瞬时沉默A549细胞STIM1表达后,72h后我们应用Transwell小室法检测细胞侵袭。6个视野中,Negative组(迁移细胞,246±23个),STIM1干扰组(迁移细胞,80±11个),因此STIM1干扰组的细胞侵袭实验中迁移细胞有减少(P0.001)。siRNA瞬时沉默A549细胞ORAll表达后,48h后我们应用Transwell小室法检测细胞迁移率。相对于Negative组(迁移率,30%±12%),ORAI1干扰组(迁移率,12%±5%),与对照组相比ORAIl干扰组的细胞迁移率有下降的趋势,虽然无统计学意义(P=0.084)。siRNA瞬时沉默A549细胞ORAI1表达后,48小时后我们应用Transwell小室法检测细胞侵袭。6个视野中,Negative组(迁移细胞,167±7个),ORAI1干扰组(迁移细胞,71±20个),因此ORAI1干扰组的细胞侵袭实验中迁移细胞有减少(P0.01)。 4.ⅢA期NSCLC患者肿瘤组织STIM1或ORAI1蛋白表达和预后的关系 4.1肿瘤组织STIM1或ORAI1表达和患者临床病理特征之间的关系 STIM1和ORAI1免疫组化阳性可见在肿瘤细胞胞浆中着色,部分胞膜着色。男性患者中有27例肿瘤组织STIM1低表达(64.3%,P=0.055);鳞癌患者中有15例STIM1(?)表达(71.4%,P=0.084);鳞癌患者中有18例ORAI1低表达(85.7%,P=0.067)。 4.2STIM1表达和ⅢA期NSCLC患者无疾病复发生存的相关性 男性NACLC患者中,STIM1低表达者预后有好于高表达者的趋势(21月vs12月,P=0.06)。鳞癌NSCLC患者中,STIM1低表达者预后有好于高表达者的趋势(33月vs9月,P=0.07) 研究结论 1.NSCLC肿瘤组织中可测到STIM1和ORAI1mRNA表达,并且腺癌中STIM1基因表达有增高的趋势,低分化肿瘤组织的ORAI1基因表达较高。 2.我们实验中发现A549细胞和16HBE细胞中存在着SOCE,并且SOCE部分参与这些细胞的增殖,而SOCE在A549细胞迁移和侵袭中起着重要的作用。 3.我们研究发现STIM1/oRAI1介导的SOCE没有参与人肺腺癌A549细胞的增殖,但在体外促进A549腺癌细胞的迁移和侵袭。 4.在鳞癌和男性ⅢA期NSCLC患者中,STIM1低表达可能预示着患者有较好的无疾病生存预后。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R734.2

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1 张奇;何建行;卢文菊;殷伟强;杨海虹;徐小明;汪道远;;经典瞬时受体电位通道蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达[J];中国肺癌杂志;2010年06期
【共引文献】
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1 朱福鸿;张萃;;瞬时受体电位通道3与疾病关系的研究进展[J];广东医学;2014年06期
2 杨海虹;邓秋华;徐小明;何萍;林云恩;;钙池操纵钙通道STIM1和ORAI1在ⅢA期非小细胞肺癌中的表达[J];实用医学杂志;2013年11期
3 翟羽佳;陈嘉;仉红刚;张静;张秋菊;修瑞娟;;N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺在体外对人脂肪间充质干细胞转分化为内皮细胞的影响[J];中国医学科学院学报;2011年03期
4 吴灿;侯国俊;支樑健;王颖;叶波平;;肌浆网/内质网钙ATP酶在大鼠肝再生过程中的表达和活性分析[J];药物生物技术;2012年06期
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3 黄召;TRPC1在原发性肝癌中的表达与临床病理特征的关系[D];中南大学;2012年
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1 廖志勇;SENNES公司的细胞生长“控制阀”SDI-1[J];药学进展;1996年02期
2 田春艳,徐光,胡昌奇,宋后燕;Miyabenol C和Kobophenol A促MCF-7细胞生长作用途径[J];复旦学报(医学版);2002年06期
3 ;肿瘤细胞比正常细胞生长快吗?[J];人民军医;1988年02期
4 周宝宏;;T细胞低亲和力IL2受体介导T细胞生长的负调节作用[J];国外医学(卫生经济分册);1988年03期
5 陈莉;IGF—Ⅰ受体对细胞生长和转化的作用[J];武警医学院学报;1996年02期
6 王占祥,章翔,费舟,王小仲;RNasin对脑胶质瘤细胞生长的抑制作用[J];第四军医大学学报;2000年08期
7 陈水平;;别把你的细胞当奴隶[J];养生大世界(B版);2008年01期
8 ;快速生长骨骼试剂盒[J];生物医学工程与临床;2010年06期
9 王萍;唐淑珍;刘晓明;丛敏;阎钟钰;尤红;王宝恩;贾继东;;黄芪刺激体外培养的大鼠肝卵圆细胞生长的作用[J];中国中西医结合杂志;2005年S1期
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1 林凯隆;张章堂;邓燕妮;赖裕顺;庄一全;;利用奈米微粒进行细胞毒性测试之研究[A];第八届海峡两岸气溶胶技术研讨会暨第三届空气污染技术研讨会论文摘要集[C];2011年
2 宋宇彤;赵旭;王秉治;;雄性小鼠生殖细胞Cdc2与P~(70)S6K相关性的研究[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
3 于小倩;彭双清;方厚华;;金属硫蛋白MT-Ⅰ/Ⅱ缺失对小鼠大脑皮层神经元生长发育的影响[A];中国科学技术协会第十届年会21分会场论文汇编[C];2008年
4 陈红风;尹剑云;;复方仙蓉颗粒对MCF10AT细胞增殖的影响[A];2011年中医外科学术年会论文集[C];2011年
5 刘古山;刘沪丽;;细胞增殖灰色模型的建立[A];第三届全国控制与决策系统学术会议论文集[C];1991年
6 吴涛;白海;王存邦;路继红;欧剑锋;;成人骨髓间充质干细胞对K562细胞生长的影响[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年
7 李擒龙;晏伟;成胜权;王文勇;张志培;王丽;张静;王文亮;;RNAi技术对APMCF1基因表达的抑制作用及其对HepG2细胞的影响[A];中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编[C];2006年
8 陈一新;郭一松;吴敦肃;;在细胞生长不同阶段Ca~■分布的变化[A];第五次全国电子显微学会议论文摘要集[C];1988年
9 刘学荣;武发菊;安芳兰;董文教;宋玉霞;董金杰;陈苗苗;牟克斌;黄银君;;不同浓度的乳酸对BHK-21细胞生长代谢的影响[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
10 贺庆芝;廖端芳;;Daxx及相关蛋白在介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡中的作用[A];湖南省生理科学会2006年度学术年会论文摘要汇编[C];2007年
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1 永诚;美发现控制细胞生长的蛋白质[N];中国医药报;2000年
2 蒋建平 编译;英专家用人类干细胞生长出心脏瓣膜[N];中国医药报;2007年
3 经天;控制细胞生长的蛋白质[N];中药事业报;2000年
4 本报记者 符王润;生长因子化妆品利器[N];广东科技报;2011年
5 陈勇;搭建细胞生长“脚手架”[N];中国医药报;2005年
6 张中桥;中药能抑制白血病细胞生长[N];健康报;2007年
7 陈茂樑 苏健;浙江开发人工胸腺技术治疗HIV感染[N];中国医药报;2006年
8 记者 郑晓春;以探索抑制癌细胞转移新途径[N];科技日报;2010年
9 本报记者 邹曦;马健会:锁定肿瘤嫌犯[N];北京科技报;2010年
10 杨秀颖;维甲酸类化合物药理学:细胞生长,分化和癌症 Retinoid Pharmacology:Cell Growth,Differentiation and Cancer[N];中国医药报;2006年
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1 樊炜亮;两个细胞自噬基因Barkor与Keap1的鉴定和功能分析[D];浙江大学;2011年
2 戴波;巨噬细胞移动抑制因子对细胞增殖、迁移、粘附的机理研究[D];南方医科大学;2009年
3 彭少华;AnnexinI在α粒子转化BEP2D细胞及肺癌组织中高表达及其基因转染对永生化BEP2D细胞生长的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2000年
4 袁健;手性钌配合物Λ-WH0402的抗肿瘤活性及其作用机制[D];南方医科大学;2010年
5 廖劲松;原生质体融合提高玫瑰茄细胞生长速率的研究[D];华南理工大学;2004年
6 江蓓;谷胱甘肽转硫酶Mu亚型在糖尿病肾病发病中的作用及干预治疗的实验研究[D];山东大学;2009年
7 林影;磁场对脆壁克鲁维氏酵母细胞生长及菊糖酶生物合成作用的研究[D];华南理工大学;1997年
8 宋锴;硫化氢在肾脏纤维化中的作用及其机制研究[D];苏州大学;2013年
9 胡轶红;两个肿瘤相关基因的结构与功能—细胞极性蛋白hASIP的不同转录本对人肝癌细胞周期和Fas/FasL介导的细胞凋亡的调节及新基因F-lana的转化作用[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
10 肖澍;RIG-G基因表达调控机制及其生物学功能的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2007年
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1 查洁;Disulfiram联合Cu对Raji细胞及其裸鼠移植瘤生长的影响及分子机制的研究[D];南方医科大学;2012年
2 俞腾飞;异源因子诱导山羊IPS细胞[D];华中农业大学;2011年
3 张建;利莫那班对肝星状细胞增殖和凋亡的影响及作用机制[D];河北医科大学;2011年
4 张岩岩;中药艾迪对人喉癌细胞Hep-2体外生长作用的研究[D];辽宁医学院;2012年
5 贾海燕;荞麦中活性成分对Hep G2细胞作用的初步研究[D];山西大学;2012年
6 王海东;C_(60)及其衍生物对细胞生长的作用和机理的研究[D];大庆石油学院;2003年
7 傅钰雁;红霉素对A549细胞的组蛋白去乙酰化酶2的影响及其对细胞周期和凋亡的研究[D];广西医科大学;2014年
8 李威;香烟导致A549细胞遗传物质损伤的实验研究[D];武汉科技大学;2012年
9 韩一;丹参抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移的实验研究[D];河北医科大学;2010年
10 李雪飞;四种中药单体对HepG2细胞枯草溶菌素转化酶9表达的影响[D];南华大学;2011年
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