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《南方医科大学》 2013年
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沉默维生素D结合蛋白基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响

陈定南  
【摘要】:研究背景: 膀胱癌是我国男性泌尿生殖系统中最常见的高度恶性肿瘤,根据美国2013年新发病例数最多的十大癌症估测,男性膀胱癌发病率排行第四,死亡率排行第八,其中病理类型膀胱移行细胞癌占90%以上。根据近年来我国部分城市肿瘤发病率报告,膀胱癌的发病率有增高的趋势。目前,膀胱镜检查及病理活检仍是膀胱癌诊断和随访的金标准,但此检查属侵入性,会给患者带来一定的痛苦和恐惧,同时临床应用上也会受到一定的限制,而尿细胞学检查为非侵人性,对诊断膀胱癌的特异性很高,但敏感性较低。由于缺乏特异性的肿瘤标志物,目前膀胱癌难以做到早期诊断,探索膀胱癌早期有效诊断的新方法已经成为临床上迫切需要解决的实际问题,并且一直是医学研究的热点与难点。近现代对于恶性肿瘤的研究表明,肿瘤的发生和发展为多因素、多阶段形成,其发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生了异常改变,致使恶性肿瘤的生物学特性表现为肿瘤细胞的无限制增殖、浸润性的生长和多方向转移。在这个多阶段的癌变过程中,癌基因的激活还有抑癌基因的失活这两个过程被认为是最重要的分子学变化。其中两大机制在肿瘤的形成过程中发挥了不可忽略的作用:是在遗传学方面通过DNA核苷酸序列的改变而形成基因的突变;另一个是表观遗传学方面出现基因表达的变化,这种变化主要通过减数分裂遗传,并不改变有关基因DNA的序列,但通过DNA自身化学修饰的方式,从转录水平影响基因的表达,特别是蛋白的表达,因而调控DNA的功能,在肿瘤的形成过程中越来越受到重视。虽然在医学上的提高和监测膀胱癌的早期检出率仍然是一个巨大的挑战。而我们最近研究发现,维生素D结合蛋白(Vitamin-D Binding Protein,又称为DBP或GC蛋白,以下简称GC蛋白)可以作为一个新的尿源性标志物,在早期的膀胱尿路上皮癌的检测和监测中发挥重要的作用,并有可能成为将来早期诊断膀胱癌的重要方法。但维生素D结合蛋白在膀胱移行上皮癌细胞中的作用尚未被阐明,所以有必要对该蛋白在膀胱癌细胞中发挥的作用作进一步的研究和探讨。 实验目的: 本实验旨在1.研究GC蛋白在膀胱癌T24细胞株与正常膀胱粘膜上皮细胞中表达的差异;2.通过RNAi干扰的方法,沉默膀胱癌T24细胞GC基因,下调膀胱癌T24细胞GC蛋白的表达,并进一步研究其对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响。 方法: 第一部分:1.细胞培养:选取膀胱癌T24细胞株及正常膀胱粘膜上皮细胞作为对照组进行细胞培养,分为膀胱癌细胞组和正常膀胱粘膜上皮细胞组。2.分别对两组细胞提取总蛋白,应用免疫印迹法,经过蛋白电泳,转膜,封闭杂交及曝光检测GC蛋白在膀胱癌T24细胞株中的表达与该蛋白在正常膀胱粘膜上皮细胞株中表达的差异。 第二部分:1.细胞培养:选取膀胱癌T24细胞株分为GC-siRNA组作为实验组、阴性对照组、空白对照组共三组,其中GC-siRNA组应用RNAi的方法,用脂质体转染siRNA干扰片段,沉默膀胱癌T24细胞维生素D结合蛋白基因(简称GC基因)的表达;阴性对照组用脂质体转染阴性对照片段,不干扰GC基因的表达;空白对照组则不作转染处理。2.分别用荧光电镜观察GC-siRNA组及阴性对照组干扰片段的转染效率。3.分别提取三组细胞的总蛋白,以免疫印迹法经过电泳、转膜、封闭杂交、曝光分别检测对比三组细胞中GC蛋白的表达的差异,检测沉默GC基因后GC蛋白在实验组的下调情况。 第三部分:1.细胞培养:选取膀胱癌T24细胞株分为GC-siRNA组、阴性对照组、空白对照组共三组,其中GC-siRNA组应用RNAi的方法,用脂质体转染siRNA干扰片段,沉默GC基因的表达;阴性对照组用脂质体转染阴性对照片段,不干扰GC基因的表达;空白对照组则不作转染处理。2.分别对各组细胞运用MTT法检测细胞增殖的情况,运用Annexin-V-PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡状况,运用Transwell试验检测细胞迁移能力的变化,观察沉默GC基因对膀胱癌T24细胞生物特性的影响。 结果: 第一部分:GC蛋白在膀胱癌细胞T24细胞中呈高表达状态,较正常膀胱粘膜上皮细胞中的表达明显增高且有显著差异。 第二部分:应用脂质体转染siRNA干扰片段沉默GC基因后,明显下调人膀胱移行细胞癌T24细胞中GC蛋白的表达,GC-siRNA组中GC蛋白的表达明显较阴性对照组及空白对照组下降,有显著差异;阴性对照组与空白对照组间的比较无明显的差异。 第三部分:1.MTT实验结果显示各组的细胞增殖情况:GC-siRNA组分别与阴性对照组和空白对照组比较,膀胱癌T24细胞的增殖水平受到抑制,有显著差异,阴性对照组与空白对照组细胞增殖情况无明显差异;2.Annexin-V-PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡情况显示:GC-siRNA组膀胱癌T24细胞的凋亡情况较阴性对照组和空白对照组明显增加且有显著差异,阴性对照组与空白对照组间的比较无明显差异;3.Transwell实验显示:GC-siRNA组膀胱癌T24细胞的迁移能力较阴性对照组及空白对照组明显下降且有显著差异,阴性对照组与空白对照组间的比较无明显差异。 结论: GC蛋白在人膀胱癌T24细胞中呈高表达,通过靶向沉默GC基因能明显下调膀胱癌T24细胞GC蛋白的表达,能明显抑制膀胱癌T24细胞的增殖能力及迁移能力,并促进膀胱癌T24细胞的凋亡,GC蛋白在人膀胱癌细胞中的高表达可能与膀胱癌细胞一系列恶性生物学特性有关。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R737.14

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