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丹参预处理对大鼠肝缺血再灌注时PERK/p-eIF2α表达的影响

高建虎  
【摘要】:背景: 已有研究证实丹参有确切的钙通道阻滞作用,能明显减轻钙超载和脂质过氧化自由基的损伤,防治缺血再灌注损伤。真核生物翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor2alpha, eIF2α)是蛋白质翻译过程中重要的调控因子,它受内质网腔内感受未折叠蛋白的感受器蛋白之一PKR样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)的调节,当内质网应激发生时,未折叠蛋白反应可使PERK活化,后者使elF-2a磷酸化为p-eIF2a, p-eIF2α对大多数mRN翻译起抑制作用,还能特异性激活某些mRNA的翻译,合成特异的蛋白质,以调节靶基因的表达,由此调节内质网内环境,减轻内质网应激,帮助内质网稳态恢复平衡,度过缺血再灌注损伤。而持续过度的内质网应激将使内质网特异性凋亡启动蛋白Caspase12活化表达,诱发经内质网途径的细胞凋亡。丹参是否能通过影响eIF2α的磷酸化,减弱未折叠蛋白反应,稳定内质网内环境,减轻经内质网途径诱发的细胞凋亡,尚未证实。本文通过观察丹参预处理对大鼠肝缺血再灌注不同时限p-eIF2α和同期Caspase12表达水平的影响,探讨丹参对缺血再灌注损伤中内质网稳态调节的可能机制,为丹参防治肝缺血再灌注损伤提供理论依据。 材料和方法: 1.材料:成年健康雄性Wistar大鼠80只,体重200±20g,购自湖北省疾病防控实验动物中心[许可证号:SCXK(鄂)2008-0005];丹参注射液[正大青春宝药业,批号:国药准字Z33020177]; β-actin(货号:Sc-1616r)和兔抗大鼠Caspase12多克隆抗体购自Santa公司(货号:sc-5627),兔抗大鼠p-eIF2a多克隆抗购自CST公司(货号:#3398);细胞总蛋白提取试剂盒、SDS-PAGI凝胶制备试剂盒和其他试剂购自谷歌生物公司。 2.实验分组:将80只健康雄性Wistar大鼠分为:正常对照组(n=5)、假手术组(n=25)、缺血再灌注组(n=25)和丹参预处理组(n=25),各实验组再根据不同再灌注时限(0h、3h、12h、24h和72h)分为5个亚组,每个亚组n=5。 3.动物模型制备:术前禁食12h,自由饮水。正常对照组断颈处死后直接进腹切取肝组织;实验各组大鼠以3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射麻醉,取上腹正中切口长约3cm;假手术组仅解剖肝门不钳夹肝蒂;缺血再灌注组进腹后向上牵开肝脏,显露并游离肝十二指肠韧带,在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min后去除动脉夹,使血液复流,制备缺血再灌注损伤模型。假手术组和缺血再灌注组断流前30min经尾静脉注入生理盐水40ml/kg;丹参预处理组肝缺血再灌注模型制备同缺血再灌注组,断流前30min经尾静脉推注丹参注射液6ml/kg加生理盐水稀释至40ml/kg。实验各组大鼠于不同再灌注观察时限点断颈处死,切取肝组织置于液氮中保存待检。 4.免疫印迹法Western Blot)检测PERK、p-eIF2α和Caspase12的表达:组织块用冷TBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器,于冰上彻底匀浆。加入10倍组织体积抽提试剂(使用前加入cooktail+磷酸化蛋白酶抑制剂)。将匀浆液转移至1.5ml离心管中,振荡,冰浴30min,反复吹打完全裂解细胞。12000r/min离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。采用Bradford方法测定蛋白质浓度,计算含40μg蛋白的溶液体积即为上样量。采用分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%的十二烷基硫化钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,分离后进行转膜(PVDF膜在使用之前先用甲醇活化,按照200mA、1h的条件进行转膜)、5%的脱脂牛奶室温封闭30min分别加入稀释500倍的PERK、p-eIF2α和Caspase12抗体,室温下孵育2h,用TBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min,将二抗用TBS1稀释3000倍,室温下孵育45min,用0.5%oTBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min,洗膜后加入二抗孵育。用化学发光法试剂作用后,X线胶片曝光,经显影、定影处理后观察结果。凝胶成像及分析系统扫描图像,以Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值,对样本和内参的比值进行比较分析。 5.免疫组化法检测PERK、p-eIF2α和Caspase12的表达: 各组肝组织取材后经过固定,石蜡包埋,4μm度连续切片,经二甲苯和梯度乙醇脱蜡和水化后,3%过氧化氢室温反应10min以灭活内源性过氧化物酶;枸橼酸缓冲液热修复抗原后,滴加山羊血清封闭液,室温反应20min;滴加适当稀释的一抗(1:100),4℃保湿过夜反应;磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)洗2min/次×3次,滴加生物素化二抗,室温反应20min; PBS洗5min/次×4次,DAB显色,显微镜下控制显色反应时间;苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。在高倍显微镜下观察免疫复合物出现部位及免疫反应强度,当细胞膜、包浆、胞核出现棕黄色颗粒物质时认为阳性结果,否则为阴性结果。采用Image pro-plus6.0软件分析免疫组化图片:每组内每张切片随机挑选10个200倍视野进行拍照,对每张照片进行分析得出每张照片阳性的积分光密度值(IOD)。 6.病理形态学观察:大鼠肝脏标本取材后经10%福尔马林固定,常规包埋、切片。按HE常规染色步骤进行染色,在光镜下观察各组病理变化。 7.统计学方法:所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,多组样本比较采用方差分析(组间比较:方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法),以P0.05为差异有显著性的判定标准。 结果: 1.Western blot检测PERK的动态变化:正常对照组和假手术组比较无统计学差异;缺血再灌注组PERK的表达0h即明显升高,3h继续升高,12h达最高值,24h虽低于其余时限但仍高于正常组和假手术组,72h也处于高表达水平;丹参预处理组PERK的表达也表现出先上升后下降的变化过程,0h开始明显上升,12h达峰值,24h有所下降,但至72h仍明显高于正常组、假手术组和缺血再灌注组。各组间比较具有显著差异(F=1927.24,P0.01),各时限点比较也具有显著差异(F=49.91,P0.01)。 2.免疫组化检测ERK的动态变化:正常对照组和假手术组比较,两组间PERK蛋白表达的免疫组化积分光密度的差异无统计学意义;缺血再灌注组PERK的蛋白表达于0h即开始升高,3h继续上升,12h达到最大值,24h开始下降,72h下降至正常水平,除72h组外的其他各组与假手术组各时限比较均有统计学意义;和缺血再灌注组相似,PERK的积分光密度值在丹参预处理组也于0h开始上升,12h达最高值,72h恢复至正常水平,除72h组外,其余各组与正常对照组以及假手术组对应各时限点比较均其差异具有统计学意义,此外除0h组和72h组其余各组积分光密度值与缺血再灌注对应时限点比较也具有显著地统计学差异。各实验组间比较具有显著差异(F=30643.55,P0.01),再灌注不同观察时限比较也具有显著差异(F=109371.6,P0.01)。 3.Western blot检测p-eIF2a的动态变化:p-eIF2a的表达在正常对照组与假手术组之间无显著性差异(P0.05),而在缺血再灌注组,再灌注3h即明显升高,12h达峰值,24h仍处于高表达水平,与正常对照组和假手术组有显著性差异P0.01),直至再灌注72h基本回落接近基线水平(P0.05);同期丹参预处理组p-eIF2α在各观察时限点的表达3h、12h、24h均显著高于缺血再灌注组(P0.01),至再灌注72h,仍处于相对高表达水平。各组间比较具有显著差异(F=258.59,P0.01),各时限点比较也具有显著差异(F=95.10,P0.01)。 4.免疫组化检测p-eIF2a的动态变化:免疫组化分析正常对照组和假手术组p-eIF2a的积分光密度值差异无统计学意义(P0.05);缺血再灌注组p-eIF2a的积分光密度值变化表现为:Oh开始逐渐升高,3h继续上升,12h达到本组最高值,24h稍有所下降但仍处于高表达水平,72h减低至接近正常组和假手术组的水平;丹参预处理组p-eIF2a的表达总体上表现出高于同期缺血再灌注组的水平,其与对照组和假手术组的差值明显高于缺血再灌注组,变化趋势也和缺血再灌注组相似,直至72h仍显著高于正常对照组、假手术组和缺血再灌注组。各试验组间比较具有显著差异(F=63.52,P0.01),不同观察时限点比较也具有显著统计学差异(F=250.07,P0.01)。 S.Western blot检测Caspase12的动态变化:正常对照组与假手术组Caspase12的表达无统计学差异(P0.05);而缺血再灌注组在缺血45min再灌注3h即明显升高,12h达到峰值,24h仍处于相对高水平,72h虽有下降,但仍显著高于假手术组和正常对照组(P0.01);同期丹参预处理组Caspase12的表达、3h、12h、24h和72h虽高于正常对照组和假手术组(P0.01),但明显低于缺血再灌注组各观察时限(P0.01)。各组间比较具有显著差异(F=287.93,P0.01),各时限点比较也具有显著统计学差异(F=70.91,P0.01)。 6.免疫组化检测Caspase12的动态变化:正常组对照组和假手术组Caspase12蛋白表达的积分光密度值差异无统计学意义;假手术组各时限点Caspase12的积分光密度值比较也无统计学差异;缺血再灌注组Caspase12的表达于0h开始上升,3h继续升高,12h到达最大值,24小时与同组12h相比明显下降,但仍高于正常组和假手术组,至72h仍处于高于正常的表达水平;各期丹参预处理组Caspase12的积分光密度值明显高于正常组和假手术组,丹参预处理组虽然表现出和缺血再灌注组一致的先升高再减低的过程,但与同期缺血再灌注组相比,丹参预处理组Caspase12的积分光密度值显著低于缺血再灌注组,具有显著的统计学差异。各实验组间比较具有显著差异(F=53.48,P0.01),不同再灌注时限比较也具有显著差异(F=189.56,P0.01)。 7.病理形态学观察:正常对照组与假手术组的肝小叶结构基本完整,肝细胞连续成索,胞核大而圆。缺血再灌注组0h可见肝细胞轻至中度水肿,肝窦间隙变窄;3h肝细胞肿胀明显,胞浆疏松化,部分出现嗜酸样变;12h时损伤最重,可见肝小叶变形,细胞体积变小,细胞核浓缩,部分出现片状坏死;24h仍可见细胞皱缩和片状坏死;72h可见肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构。与之相比,同期丹参预处理组的损伤比缺血再灌注组轻,3h表现出轻度的细胞肿胀,12h肝细胞肿胀稍重,出现轻微的点状坏死,24h在点状坏死的基础上即有一定程度的肝细胞增生表现,72h组织形态学接近正常。 结论: 本实验结果显示肝缺血再灌注早期PERK(Oh)和p-eIF2a(3h)表达就呈上升状态,明显高于正常对照组组和假手术组,这是肝缺血再灌注致内质网应激启动的标志。而丹参预处理组p-eIF2α的表达在自3h~72h整个观察时限始终高于未处理组,同期Caspase12的表达显著低于未处理组。这一结果表明,丹参预处理有助于增强再灌注期PERK、p-eIF2α的表达,通过PERK/p-eIF2α通路阻抑过度的经内质网途经的细胞凋亡,具有积极的细胞保护作用。


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