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《南方医科大学》 2013年
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第二代高通量测序分析VVC及BV患者阴道菌群多样性

许苏容  
【摘要】:研究背景 阴道微生物群落对于维护阴道内环境稳定,预防生殖道及泌尿道的感染非常重要,因此,明确阴道微生物群落的组成与动态变化对于我们理解这些疾病的发病和采取治疗及预防措施无疑会帮助较大。 以前,我们基本上是基于显微镜检查和传统培养法而获得阴道微生物群落信息的认知。基本公认乳酸杆菌为阴道的优势菌群,其通过空间占位,营养竞争,产生乳酸、H2O2、生物素,刺激机体免疫功能等机制维持着阴道的酸性环境(3.8-4.2),抑制着阴道内其它菌群的生长。但是,由于阴道菌群众多,其中一些很难通过传统纯培养和分离鉴定的方法得知。近年来随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展,一些新方法的出现,给我们进一步明确阴道微生物群落组成带来了可能。自聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction, PCR)建立至今,该技术的发展十分的迅速,应用也在日趋的多元化。基于16S rRNA基因PCR扩增是目前最常用的检测阴道微生物的非培养法,使得微生物的分类鉴定从表型特征鉴定,深化为基因特征鉴定。随着第二代高通量测序技术的发展,如Roche454高通量测序平台和Illumina Solexa高通量测序平台等,使得测序通量和准确性有了很大的提高,但由于成本因素,目前还仅仅局限在几个小组运用。周宏伟等在第二代高通量Solexa测序平台的基础上,通过配对双末端测序策略测定16S段片段,并融合条码(barcode)技术,建立了Barcoded Paired-End Illumina Sequencing (简称BIPES)法,从而使这一新的第二代高通量测序法具备了操作简便,成本低廉,重现性好等优点,让临床研究中简便、快速获得全面、系统、结构化的微生物群落结构信息成为可能。 我们知道,外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)与细菌性阴道病(BV)是临床常见的两种阴道炎性疾病,其发病均非源自外源性的微生物感染,而与阴道内自身微生物群落的构成及微环境变化有关,但是,对于其发病时和治疗后,阴道内微生物种群究竟呈现何种变化,目前尚无定论。本研究利用BIPES对健康育龄期女性、VVC患者、VVC近期治愈后患者及BV患者的阴道菌群进行检测,以期在低成本的条件下对阴道菌群有更准确全面的认识,为进一步探讨VVC及BV的病因及其治疗与预防提供依据。 方法 1.实验对象与目的: 实验一:比较不同部位的菌落组成是否存在差异。随机选取门诊患者27例,年龄在21-47岁,中位年龄34岁,月经规律,知情同意后,用无菌阴道棉拭子于阴道穹窿及阴道下1/3段各取两管分泌物。 实验二:检测VVC患者治疗前后阴道微生物种群的构成状况。①VVC组:初诊共44例,年龄在20-45岁,中位年龄32岁。为2011年6月至2011年11月在南方医科大学珠江医院妇产科门诊的患者。纳入标准:符合高等学校教材第7版《妇产科学》诊断标准。②VVC近期治愈后组:WC组患者给予以下方案治疗:氟康唑150mg,口服,一日1次,连续4日;盐酸特比萘芬阴道泡腾片一日1次,一次1粒,阴道上药,连续7日;除湿止痒洗液,坐浴,停药10至14天后共有28例复诊,均症状消失及阴道分泌物镜检念珠菌阴性。③正常对照组:共39例,为同期本院健康门诊体检育龄期妇女,年龄在21-49岁之间,中位年龄35岁。通过详细病史询问、阴道清洁度分级、阴道分泌物Nugent评分,纳入标准为同时满足以下三项:①无临床症状;②阴道清洁度分级为Ⅰ-Ⅱ级;③Nugent评分在0-3分。 实验三:检测BV患者阴道微生物种群的构成状况。①BV组:共37例,年龄在22-48岁,中位年龄34岁,为2012年01月至2012年03月在南方医科大学珠江医院妇产科门诊的患者。纳入标准:Amsel临床诊断标准的4项内容,其中以发现线索细胞为必备项目+其他3项中的任意2项阳性,同时Nugent评分≥7分诊断为BV。②健康育龄期女性组:共37例。符合实验二正常对照组的纳入标准。 以上各组均为我国汉族人,同时满足以下条件:患者一月内无全身应用抗生素及阴道局部用药史,3天内无性生活史,非妊娠期、哺乳期或月经期,无糖尿病,没有同时患有滴虫性、或其它阴道炎症。 实验二、三各组实验对象知情同意后,用无菌阴道棉拭子于阴道穹窿取两管分泌物。 2.采用法医DNA提取试剂盒(深圳易瑞)提取样本总DNA,具体操作步骤参照说明书。 3.16s rRNA V6区基因片段的扩增及Illumina测序:以样本总DNA为模版,采用引物967F和1046R扩增其中的16S rRNA V6区基因。PCR产物以相等的终浓度混合均匀,通过Illumina HiSeq2000平台进行双末端100bp测序(华大基因,深圳)。 4.测得序列经过barcoded Illumina paired-end(PE) sequencing (BIPES)流程进行初步处理。使用TSC进行聚类,提取出每个操作分类单元(Operational taxonomy unit, OTU)的代表序列后利用GAST进行物种的分类,其中属于乳酸菌属的OTU利用megablast进一步分到种级别,后续分析包括聚类分析,Alpha多样性和beta多样性分析。基于Unifrac距离,采用QIIME进行阴道菌群主成分分析。采用linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements (LEfSe)在线工具分析患者特殊的阴道菌群。 结果 实验一: 1.阴道穹窿和阴道下1/3段分泌物的微生物群落趋近于相同。 实验二: 1.VVC患者的阴道菌群结构可分成四种类型: (1)VVC_Ⅰ型的阴道菌群以乳酸杆菌占优势(丰富度范围95.4%-99.7%,平均98.5%),与健康育龄期女性阴道菌群相似,仅存在两个乳酸杆菌菌种,惰性乳酸杆菌或者卷曲乳酸杆菌; (2)VVC-Ⅱ型仍以乳酸杆菌占优势,但丰度水平低于VVC_Ⅰ型。乳酸杆菌的丰富度范围73.2%-93.8%,平均84.2%,WC_Ⅰ型和VVC_Ⅱ型之间的乳酸杆菌菌属没有统计学差异。全部VVC_Ⅱ型的样品由惰性乳酸杆菌占优势,一些标本还存在小比例的卷曲乳酸杆菌,格氏乳杆菌或詹氏乳酸杆菌,VVC_Ⅱ型较VVC_Ⅰ型Alpha及beta多样性明显增加; (3)VVC_Ⅲ型样品显示较之前两型更复杂的菌群信息,乳酸杆菌仍比较常见,但明显不同于WC_Ⅰ型,丰富度降低明显,占18.9%-48.8%,平均33.9%。在这型惰性乳酸杆菌仍是常见的菌种,加德纳氏菌属成为一个优势菌群,占24.3%-43.5%,平均33.9%; (4)WC_Ⅳ型阴道菌群Alpha多样性及beta多样性明显增加,乳酸杆菌降低至3.2%,甚至消失,大部以加德纳氏菌属占优势,颗粒链球菌属、普氏菌菌属、戴阿李斯特杆菌属、厌氧球菌、纤毛菌属、微单胞菌属、动弯杆菌、丹毒丝菌属等丰富度明显增加。 2.抗真菌治疗后患者临床症状消失,病原诊断阴性,但大部分阴道菌群都没有像期待那样恢复正常,个体差异大,VVC_Ⅰ型治疗前几乎是正常的阴道菌群,复诊的4位患者的加德纳氏菌属较治疗前增加,其余6位阴道菌群变化不大。有2位来自VVC_Ⅱ型的复诊患者,她们的阴道菌群以链球菌占优势,其余4位VVC_Ⅱ型的复诊患者,治疗后卷曲乳酸杆菌丰富度增加。VVC_Ⅲ型治疗后加德纳氏菌属丰富度降低,惰性乳酸杆菌丰富度升高,但未恢复正常,仅有2例恢复正常。2位VVC_Ⅳ型的复诊患者,加德纳氏菌属明显减少,但阴道菌群也是以链球菌占优势。另外2位VVC_Ⅳ型的复诊患者,加德纳氏菌属丰富度减少,纤毛菌属、普氏菌菌属消失,也出现了少量的链球菌。 实验三: 1.通过稀释曲线、Observed OTU和Shannon多样性指数对比显示BV患者的阴道菌群Alpha多样性较健康育龄期女性的明显增加; 2.通过PCoA Unifrac距离及primer聚类显示BV患者的阴道菌群beta多样性较健康育龄期女性的明显增加; 3.在菌属的水平上,健康育龄期女性相对丰度最高的是乳酸杆菌,约占95%甚至更高,在乳酸杆菌种的水平上,大部分人以惰性乳酸杆菌或卷曲乳酸杆菌为主,或两者比例相当; 4.BV患者乳酸杆菌明显减少甚至消失,且以惰性乳酸杆菌为主。 结论 1.阴道穹窿与阴道下1/3段的分泌物的微生物群落趋近于相同,即在阴道内不同位置取材对菌群分析影响不大; 2.VVC患者阴道菌群存在四种表型,具有多样性的特点; 3.健康育龄女性阴道菌群是以乳酸杆菌占绝对优势,单独以惰性乳酸杆菌或卷曲乳酸杆菌为主,或者两者相当,并与多种微生物并存; 4.VVC患者抗真菌治疗后,近期治愈后阴道菌群变化并非立即恢复到正常状态,而个体差异较大; 5.大部分BV患者阴道菌群表现为乳酸杆菌显著减少甚至缺失,小部分BV患者以少见的格氏乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌为优势菌群。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R711.31

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