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《南方医科大学》 2013年
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正常与疾病心脏兴奋—收缩偶联调节机制的研究

邓建新  
【摘要】:第一章KCNE2调节心脏L型钙通道特性及其机制 目的:众所周知,KCNE2在维持心脏电生理的稳定性中起着非常重要的作用。有研究报导,KCNE2的突变体与长QT综合症及房颤/短QT综合症有着很明确的关系。而KCNE2作为钾通道的一个p辅助亚基,其在调整电压依赖性阳离子通道中的具体功能非常复杂。在心脏中,L型钙通道在动作电位复极平台期中又起着非常重要的作用,那么KCNE2是否能够调节LCC的通道功能呢?目前还不得而知。因此,这章节本研究了KCNE2在调节心脏的LCC通道中所起的作用及病理生理学意义。 方法:分离15只成年SD大鼠(性别不限)心肌细胞,并进行培养,每次实验随机分为四组:GFP、KCNE2、shRNA、shRNA-KCNE2,并记录钙电流及动力学指标。采用SPSS13.0统计分析软件包进行分析,方差齐时,L型钙电流密度、LCC的动力学指标在多组间的比较采用One-Way ANOVA方法,两两比较采用LSD法;方差不齐时,多组间比较采用Welch检验,两两比较采用Dunnett'T3方法;蛋白表达量采用单样本t检验。以P0.05为差异统计学意义。 结果:L型钙电流密度在四组间差异有统计学意义(F=8.659,P0.001);在大鼠心肌细胞中过表达KCNE2时可以降低钙电流密度峰值18%(P=0.008),而低表达KCNE2则上调29%钙电流密度峰值(P0.001)。改变KCNE2表达也可以改变LCC的动力学指标(F=4.288,P=0.007)。过表达KCNE2引起电压依赖性激活的正移(P0.001),稳态电压依赖性失活过程左移,并使得LCC从失活后的恢复时间延长(P0.001),而当低表达KCNE2,LCC通道动力学效应则恰恰相反(P=0.003)。在异源表达系统HEK293细胞中,通过质粒转染后可以得到同样的实验结果。免疫共沉淀和免疫染色技术发现,不管是在心肌细胞还是在293细胞中,Cav1.2和KCNE2都存很好的共定位现象。另外,一种家族性房颤有着密切相关的KCNE2突变体R27C,可以放大KCNE2对LCC的这种调控作用,过表达时对LCC的抑制作用更为强烈。 结论:KCNE2与LCC的a亚基Cav1.2存在共定位现象,KCNE2并起着调节LCC通道功能。这种调节作用在维持心脏电稳定性是非常重要的。KCNE2突变体R27C可以增强KCNE2调LCC作用,并可能通过部分抑制ICa,L和缩短动作电位时程从而导致家族性房颤。 第二章虎杖苷对大鼠心室肌细胞钙调控和兴奋收缩偶联的调节作用及机制 目的:探讨虎杖苷对心肌细胞的钙信号及兴奋-收缩耦联调控机制,从而探讨虎杖苷介导的心脏保护作用。 方法:急性分离18只SD大鼠(性别不限)心肌细胞,随机分为四组:control、1uM PD、10uM PD和100uM PD。使用膜片钳技术观察虎杖苷对L型钙电流的影响,通过激光共聚焦显微技术检测虎杖苷对大鼠心室肌细胞钙火花发放频率、钙库水平、钙瞬变以及兴奋-收缩偶联效率的作用。 结果:1、方差分析结果显示,钙瞬变和收缩幅度在各组间差异有统计学意义,F分别为:3.548和10.854,P值分别为0.015和0.001。微摩量级的虎杖苷可以降低收缩期钙瞬变水平(P=0.021),但同时增加心肌细胞收缩性(P=0.030)。2、心肌细胞L型钙电流密度在各组间差异有统计学意义(F=6.545,P0.001),不同虎杖苷呈浓度依赖性降低心肌细胞L型钙电流密度(P分别为0.036,0.006,0.001)。3、不同浓度的PD可以改变钙火花的发放频率(F=25.802,P0.001)。虎杖苷可以增加单个心肌细胞钙火花的发放频率(P均<0.001),同时降低肌浆网钙库水平(P=0.017和P0.001)。4、10uM虎杖苷可增加兴奋收缩偶联效率(t=-14.404,P0.001)。5、不同的刺激下钙电流幅度差异有统计学意义(F=58.369,P0.001),虎杖苷可以抑制ISO引起的钙电流幅度(P0.001)及钙瞬变增加的水平(P0.001),然而不影响beta-AR正性心肌收缩力作用(P=0.865)。 结论:虎杖苷通过促进细胞分泌NO,降低L型钙通道电流,增加雷诺丁受体反应性及肌原纤维对钙的敏感性,最终导致钙瞬变水平降低而不影响心肌收缩力,即增加心肌兴奋收缩偶联效率。这提示我们虎杖苷在钙调控紊乱相关的心脏疾病中具有潜在的心肌保护作用。 第三章烧伤血清对大鼠心室肌细胞兴奋收缩偶联的调节作用及其分子机制 目的:心肌抑制因子早已被认为存在于烧伤血清(BS)中,并在烧伤所致心功能障碍中起着重要的作用。然而,烧伤血清在心功能障碍的发展过程中的细胞和分子机制尚不清楚。在本研究中,我们研究了烧伤血清对大鼠心肌细胞的钙调控过程及心肌收缩力的作用及其机理。 方法:急性分离10只成年SD大鼠(性别不限)心肌细胞,随机分成3组:对照组,烧伤血清作用20min组和作用60min组,并分别记录钙电流、钙瞬变、钙火花、钙库等钙信号指标。 结果:通过给予1Hz场刺激心肌细胞,在给予烧伤血清的开始20min内钙瞬变幅度和心肌收缩力有所增加(F=25.738,P0.001),差异有统计学意义,与对照组相比,增加的幅度分别为:28.0%(P0.001)和34.7%(P0.001)。随着烧伤血清作用时间的延长,钙瞬变的幅度和心肌收缩力反而有所下降(F=24.609,P0.001),与对照组相比,在作用60分钟后分别下降了20.5%(P0.001)和32.3%(P0.001)。进一步实验说明,在烧伤血清作用的开始阶段(前20min)肌浆网钙库容量水平并没有改变(P=0.781),随着时间的延长,钙火花发放的增加(F=22.898,P0.001),钙库容量水平也有所改变(F=32.299,P0.001),BS作用60min时与对照组相比SRload下降了32.0%(P0.001)。肌浆网钙库水平的变化与钙瞬变以及心肌收缩力的变化是相符的。在给予烧伤血清刺激的整个过程,自发钙火花和自发钙波发放频率方差分析结果显示组间有统计学意义,F值分别为:39.784和22.898,P均0.001,主要表现为发放频率增加(P均0.001)。然而这种过度活跃的钙火花和钙波可以通过抗氧化(vitamin A,0.2mM; and vitamin E,1mM)治疗来抑制。通过抗氧化干预,烧伤血清引起钙火花发放频率增加的效应受到抑制,烧伤血清引起的心肌细胞钙瞬变(F=0.305,P=0.821)及心肌收缩力的改变(F=0.284,P=0.837)也恢复正常。 结论:烧伤血清引起的双向调节心肌细胞兴奋收缩偶联作用与氧化应激所致雷诺丁受体高反应性存在很大关系,在作用的始起阶段,胞内钙释放的增加引起了兴奋收缩偶联的提高,在作用的末阶段,钙火花介导的钙漏流导致肌浆网钙库容量部分耗竭,最后引起心肌细胞兴奋收缩偶联的下降,心肌收缩力降低。 第四章虎杖通过减少雷诺丁受体的氧化修饰来抑制肌浆网Ca2+泄漏从而保护烧伤大鼠心功能 目的:前期的工作证实,烧伤引起的心脏中肌浆网钙漏流主要是由于雷诺丁受体活性过度活跃。肌浆网钙漏流进而引起肌浆网钙库水平下降,并引起胞内钙紊乱,最终引发烧伤心功能障碍的病理变化。在这一章中,我们着重研究了虎杖苷(白藜芦醇的葡萄糖苷形式)通过抑制肌浆网钙漏流所致烧伤所致心功能障碍中的作用及其机理。 方法:28只SD大鼠随机分成四组:对照,虎杖苷组,烧伤组和烧伤+虎杖苷组。烧伤组制作30%体表面积烧伤大鼠模型。采用SPSS13.0统计分析软件包进行分析,方差齐时,多组间的比较采用One-Way ANOVA方法,两两比较采用LSD法;方差不齐时,多组间比较采用Welch检验,两两比较采用Dunnett'T3方法。以P0.05为差异统计学意义。 结果:方差分析结果显示:组间心功能各指标(LVSP、±dp/dt在各组间差异有统计学意义,F值分别为77.726、41.798和82.672,P值均0.001)。伤后给予虎杖苷治疗可以很好地改善烧伤大鼠心功能(P0.001)。虎杖苷可以改善烧伤后大鼠心肌细胞的钙瞬变(P0.001)及心肌收缩力(P0.001)。各组钙火花发放水平方法分析显示组间差异有统计学意义,F=15.871,P0.001。进步分析发现严重烧伤可以引起心肌细胞中雷诺丁受体活性增加,自发钙火花发放频率的增加(P0.001),而钙火花发放的过多则会引起肌浆网钙库水平下降(P0.001)。进一步的研究发现,心肌细胞里RyR2通道中的自由巯基含量(通过mBB荧光信号反映)在烧伤所致的心功能障碍大鼠中降低(P0.001)。烧伤后及时给予虎杖苷治疗可以降低心肌细胞内ROS水平(P=0.008),最后恢复RyR2通道中的自由巯基含量(P=0.009)。伴随而来的结果是,虎杖苷纠正了钙火花介导的肌浆网钙漏流,并恢复其钙库容量水平。收缩期钙瞬变幅度和心肌收缩力通过PD治疗后得到明显的改善。 结论:本研究提示我们虎杖苷通过减少Ryr2通道中的氧化应激水平来防止钙火花介导的钙漏流增加,从而起到保护烧伤心功能的作用。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R363

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