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红背叶根不同提取物对急性免疫性肝损伤治疗作用的研究

杨静雯  
【摘要】:研究背景: 肝脏具有分泌、排泄、合成、生物转化及免疫等多种生理功能,各种致肝损伤因素如感染(尤其是肝炎病毒感染)、药物、酒精等作用于肝脏后,可导致肝脏器质性及功能性受损,一方面可以引起肝脏组织变性、坏死、纤维化等结构改变,还能导致各种肝功能障碍,出现黄疸、继发感染、肾功能障碍、腹水、肝性脑病等一系列综合征。肝损伤是多种肝脏疾病共有一种病理状态,其长期存在往往是导致肝纤维化,甚至肝硬化、肝癌发生的最重要的始动因素,肝损伤的治疗对肝硬化、肝癌的预防和干预治疗有重要意义。因此防治肝损伤是临床肝病治疗的主要环节之一,也成为肝病实验研究的热点。 肝损伤可分为化学性和免疫性肝损伤,其中,免疫性肝损伤是一个大范畴,是许多肝脏疾病的共同病理过程,如自身免疫性肝病、自身免疫性肝炎等等,目前,多数学者认为乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关。我国是乙肝大国,中国的慢性乙肝病人中,约25%~40%最终将死于肝硬化或合并肝癌。现尚有研究表明,药物性肝损伤也有由免疫机制参与介导而引起,譬如药物或其代谢产物所引起的肝脏损伤激发的免疫反应及药物过敏反应。肝损伤作为多种急慢性肝病的共同病理基础,涉及范围广泛,如果能有效控制并治疗肝细胞损伤,将会大大改善广大肝病患者的预后。 现代医学对肝损伤的研究比较深入,已从多方面探讨了肝损伤的发生机制:氧化应激反应、相关细胞因子的作用、核因子-kB的参与、细胞凋亡、钙蛋白酶、一氧化氮的作用,等等,并通过在抑制肝组织中脂质过氧化、减少炎症细胞浸润、保护肝细胞膜、改善血清学检测结果等方面开发出了膜保护剂、抗脂质过氧化剂及免疫调节剂等保肝药物,目前临床上常用的西药有:甘草酸二铵、联苯双酯、还原型谷胱甘肽、腺苷蛋氨酸、多烯磷脂酰胆碱、熊去氧胆酸、硫普罗宁、双环醇等,这些药物均有临床及实验证实其具有保肝、护肝等相关作用,但不足之处尚有远期疗效不稳定,相关的不良反应报道渐渐出现,部分药品价格不菲等等,限制了临床应用。 祖国医学对肝损伤的辨证施治有其独特的优势。中医认为急性肝损伤的病因多为感受时邪,或饮酒过度,或情志失调,或久病体虚等,其主要病机是:正虚不能抗御外邪以致湿热毒邪入侵,由气入血,肝气血运行不畅则可横阻脾胃,脏腑功能失调,血脉受病,复而肝络瘀阻。湿热毒邪是致病的基本因素,正虚是发病和邪气滞留的关键,湿阻、血瘀是病证的主要特点,故主张解毒、清热、祛湿、益气、活血作为治疗急性肝损害的常用基本法。其相关病证可属中医“胁痛”、“黄疸”、“酒疸”、“药毒”、“瘾瘕”等范畴。大量的临床及实验研究表明中药在治疗肝脏疾病有其多途径、多层次、多靶点的作用,且毒副作用较小,具有资源丰富,价格便宜,疗效好等优点,在治疗肝损伤方面有独具一格,而且中药抗肝损伤尚有相当广阔的研究空间。 祖国地大物博,药材资源丰富。岭南药材红背叶根为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchomea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根,别名红灵丹、红罗裙、红帽顶、红背娘、红骨白颧树根等,在岭南地区分布广泛。《广西中草药》记载其味甘,性凉,根四季可采,具有:“清热解毒,祛风除湿,散瘀止血,平喘,杀虫止痒等作用”。归小肠、膀胱经,传统应用于治疗肠炎腹泻,痢疾,黄疸型肝炎,尿路感染和结石,肾炎,小便不利,尿血,血崩,白带,湿疹,荨麻疹,疮痈肿毒,疮疡久不收口,龋齿痛,外伤出血等症。《常用中草药手册》称其能“治腰腿痛”。民间常用为保肝治肝药物。 近代医学研究表明,红背叶根中含大量生物碱和酚性物质,具有止咳、祛痰作用,抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。 目前对于红背叶根的研究尚少。本课题组首次发现并证明了红背叶根对CC14复合因素及酒精性肝纤维化大鼠均有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用,对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤具有显著的保护作用。体外实验证明,红背叶根水提物,醇提物,生物碱对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用,并证明了红背叶根提取物生物碱属于有效低毒药物。临床实验表明红背叶根水煎剂能改善慢性乙型肝炎患者肝区不适等症状及转氨酶结果,具有抗乙肝病毒功效。红背叶根能显著降低肝纤维化大鼠全血黏度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率、红细胞压积、肝纤四项、ALT和AST指数,改善纤维化大鼠舌下及耳廓络脉的循环状态,提示“活血通络”可能是其抗纤维化的主要病机之一。进一步研究表明,红背叶根水提物、醇提物及总生物碱均对CC14所致小鼠急性肝损伤均有一定的保护作用。 本课题组前期曾进行过红背叶根对肝损伤的保护作用的研究,对治疗作用方面的实验研究尚有欠缺,且实验多为对红背叶根粗提物的研究,并未作其不同的部位提取物作进一步研究。过去曾采用过卡介苗+脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤模型、CC14诱导的化学性肝损伤模型,并未使用过Con A诱导的免疫性肝损伤模型,为了综合判断红背叶根的药物疗效,我们在本实验中使用了ConA诱导的急性肝损伤模型。 刀豆蛋白A诱发的小鼠急性肝损伤模型被证实为以CD4+T淋巴细胞为主介导的免疫性肝损害。其病理生理过程与人类乙型肝炎中T淋巴细胞介导的肝细胞损伤类似,具有肝脏依赖性、剂量依赖性等特点。此模型无需预先致敏,操作简便,发病迅速,肝损伤明显,适合用于研究人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病,是筛选急性肝损伤和暴发性肝衰竭治疗药物比较理想的动物模型。本实验采用此种造模方法来探讨红背叶根提取物对小鼠免疫性肝损伤的治疗作用。 研究目的: 本课题组在前期研究所得成果的基础上,通过不同提取溶剂对红背叶根的不同化学成分部位进行提取,通过实验研究得出红背叶根不同提取物对急性免疫性肝损伤的治疗效果,以明确红背叶根治疗肝损伤的有效部位,并初步评估其抗肝损伤的机理,进而为分析其确切的有效成分及深入研究其具体的抗肝损伤机制,研究开发新药奠定理论和实验基础。 研究方法: 1.实验药物: 红背叶根采自广东惠州,经南方医科大学中药鉴定与药用植物教研室鉴定为大戟科植物红背山麻杆的根。以蒸馏水溶解红背叶根干膏粉,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2次,挥干得相应提取物。4种不同提取物由南方医科大学中医药学院药剂室提供,均分高、中、低剂量(15.6g生药/kg、7.8g生药/kg、3.9g生药/kg)组,按药效学原则与蒸馏水混合制成水溶液。阳性对照药甘利欣。 2.实验动物: SPF级NIH雄性小鼠,体重18-22g,170只(广东省实验动物中心提供),适应性饲养3天后进行实验。 3.红背叶根不同提取物对急性免疫性肝损伤治疗作用的实验研究: 3.1实验动物造模、分组适应性饲养3天后,随机抽取10只作为正常组,余小鼠予尾静脉注射Con A溶液(15mg/kg),正常组注射等量无菌生理盐水。8h后剔除死亡小鼠,将造模小鼠随机均分成Con A模型组、对照药甘利欣组及红背叶根4种提取物(原药水提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物)各分高、中、低剂量组。本实验共15组,每组10只,标号1-10号。 3.2分组后处理分组后,将红背叶根4种不同提取物均按药效学原则,以3.9g生药/kg,7.8g生药/kg,15.6g生药/kg为低、中、高剂量灌胃给药,对照药甘利欣按100mg/kg的剂量灌胃给药,正常组和Con A模型组以等体积生理盐水灌胃,0.5m1/(只.d),连续给药3d,末次给药后禁食不禁水12h。 3.3检测指标 3.3.1血清学检查摘眼球取血分离获得血清,由南方医科大学中西医结合医院检验科模块化生物免疫分析仪检测ALT和AST,按试剂盒说明操作检测TNF-α,IFN-γ. 3.3.2肝组织匀浆检查处死动物,取肝左叶同一部位,称取1g左右肝组织,以重量(g):体积(ml)=1:9比例加入生理盐水研磨制成肝组织匀浆,离心取上清得10%肝组织匀浆上清液,按试剂盒说明,先用BCA蛋白测定液检测出各组织蛋白含量,再检测并计算出SOD,MDA含量。 3.3.3肝组织病理学检查取肝左叶同一部位,以10%中性福尔马林浸泡固定,常规脱水,石蜡包埋后切片(4μm),HE染色,中性树胶封片,光镜下观察肝组织病理学变化。 3.3.4统计处理方法实验数据用统计软件SPSS13.0进行分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较用one-way ANOVA。方差齐性时,采用LSD方法进行组间多重比较;方差不齐时,采用DunnettT3方法进行组间多重比较。两组等级资料用非参数检验中的2Independent Samples Tests进行数据处理。P0.05定为差异有统计学意义。 结果 1.与正常组相比,模型组血清ALT、AST水平显著升高(P0.01), ALT、AST在各组间差异有统计学意义,ALT(F=4.908, P0.001),AST(F=4.367, P0.001),提示Con A注射后对小鼠肝细胞造成了严重的损伤。红背叶根4种提取物各剂量组及甘利欣组小鼠的血清ALT、AST水平与模型组相比有不同程度的降低,统计有显著差异(P0.01),提示药物对肝细胞损伤有不同程度的治疗作用。甘利欣组与模型组相比有显著差异(P0.01)。各提取物组与甘利欣、正常组及组间比较表明,原药效果最佳,以中高剂量组为优,其次为酯提取物中剂量组,醚、醇提取物效果次之,以中剂量组效果较好(P0.01)。 2.与正常组相比,模型组血清TNF-α和IFN-γ水平显著升高(P0.01),表明小鼠体内发生炎性反应。红背叶根4种提取物各剂量组及甘利欣组小鼠的血清TNF-α和IFN-γ水平与模型组相比均有不同程度的降低,统计有显著差异(P0.01),说明药物在小鼠体内起到一定的抗炎作用。其中原药高、中、低组,醇高组及酯高、中组降低TNF-α和IFN-γ的作用更显著,与正常组及甘利欣组相比,两项指标均无明显差异(P0.05)。 3.与正常组相比,模型组小鼠肝组织中SOD活力显著降低(P0.01), MDA含量则显著升高口0.01),表明造模后小鼠肝组织出现氧化损伤。与模型组相比,红背叶根4种提取物各剂量组及甘利欣组SOD活力水平均有不同程度的升高,MDA含量明显降低,其中原中组、醇中组、醚中组、酯中组及甘利欣组在增强SOD活力及降低MDA水平上均作用显著,差异有统计学意义(P0.01,P0.05),提示药物能提升SOD的活力,增强抗氧化损伤能力,作用效果较好。各有效组与甘利欣组比较均无明显差异(P0.05)。 4.小鼠肝脏肉眼观察模型组肝脏肿大,颜色改变、肝组织呈现颗粒样外观,表面可见大小不等的坏死斑或瘀点瘀斑。各给药组肝脏病变较模型组轻。正常组肝脏未见明显异常。 光镜观察模型组小鼠肝细胞肿胀变性明显,可见散在点状坏死甚至大片状坏死,汇管区及坏死组织周围大量炎性细胞浸润,正常组未见明显异常,两组相比,肝细胞变性及坏死等病变差异显著(P0.01),表明造模成功。在肝细胞肿胀变性方面,各给药组除醇高、醚低、醚高、酯低、酯高组效果与模型组差异不大外,其余各组均有显著差异(P0.05),说明药物可减轻肝细胞的肿胀变性。在肝细胞坏死方面,除醇低、醇高、醚中、酯低及酯高组效果与模型组相比差异不显著外,其余各组均有显著差异(P0.05),说明药物可有效对抗肝细胞坏死。对照药甘利欣在肝细胞肿胀及坏死方面均有改善作用(P0.05)。其中,原药高中低剂量组对改善肝细胞肿胀及坏死均有治疗效果,酯提取物只有中剂量组在两方面有效,提示原药组效果较各提取物组好。醚中组、醇中低组对减轻肝细胞肿胀起作用,醚高低组及醇中组在改善肝细胞坏死方面作用明显。 结论: 1.以Con A予小鼠尾静脉注射后,血清转氨酶、TNF-α、IFN-γ及肝组织MDA含量明显升高,SOD活力则显著降低,病理组织显示肝细胞肿胀、坏死明显,汇管区及坏死组织周围大量炎性细胞浸润,证明本实验复制的小鼠免疫性肝损伤模型获得成功。 2.红背叶根4种不同提取物可显著降低小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平,改善肝组织病理形态。初步认为红背叶根4种不同提取物对Con A诱导的急性免疫性肝损伤均有治疗效果。在降低转氨酶水平方面,以原药效果最佳,以中高剂量组为优,其次酯提取物中剂量组,与甘利欣组效果无显著差异(P0.05),醚、醇提取物效果次之,以中剂量组效果较明显。在改善肝脏组织形态方面,原药高中低剂量组及甘利欣组对改善肝细胞肿胀及坏死均有效果,酯提取物只有中剂量组在两方面有效。 3.红背叶根4种不同提取物可降低小鼠血清TNF-α、IFN-γ及肝组织中MDA的含量降低,提高SOD活力,表明红背叶根提取物具有抗氧化及抗炎作用。其中,原药高、中、低组,醇高组及酯高、中组在抗炎方面效果较好;而原中组、醇中组、酯中组、醚中组还兼具增强SOD活力及降低MDA水平的良好作用。 4.初步推断红背叶根各提取物抗急性免疫性肝损伤的机制可能与增强肝细胞抗氧化应激能力、抑制脂质过氧化反应,及减少炎症细胞因子产生,减轻其炎症反应有关。 5.结合各项指标结果,认为原药组效果较余提取物组好,而且同等剂量浓度的原药效果优于部位提取物。总体治疗效果,以中剂量浓度为适宜治疗浓度。


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