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《第一军医大学》 2000年
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c-fms癌基因异常激活机制及携带AFP增强子反义c-fms与肝癌的研究

崔俊  
【摘要】: 背景 集落刺激因子1受体(colony stimulating factor 1 receptor, CSF-1R) 是c-fms癌基因编码的产物,在肝癌发生过程中呈高表达状态,但表达 的机制尚不清楚。CSF-1R具有酪氨酸激酶活性,通过多信号传导途径 影响肝癌的发生发展。人CSF-1R第301位密码子含有一活化的突变位 点,该位点一旦发生正常的亮氨酸Leu(TTG)→丝氨酸Ser(TCG) 置换后,CSF-1R可模拟其配体CSF-1诱导的构象变化,导致CSF-1R 酪氨酸激酶自身的失控性激活,通过一系列信号传导机制导致细胞的生 长分化异常,最终导致肿瘤发生。人CSF-1R第969位酪氨酸及其附近 的氨基酸,对CSF-1R酪氨酸激酶活性具有负性调节作用,当该位点发 生缺失或突变后,可上调CSF-1R酪氨酸激酶活性,通过前述信号传导 机制参与肿瘤的发生。目前研究认为,癌基因低甲基化是导致其异常高 表达的一种重要分子机制。部分癌基因编码的产物是生长因子和/或生 长因子受体,癌基因通过低甲基化机制表达大量的生长因子/生长因子 受体,通过自分泌/旁分泌机制促进肝癌的发生发展。人CSF-1R第571 位酪氨酸对CSF-1R酪氨酸激酶的激活及信号转导是必须的。反义基因 作为肝癌的一种生物学治疗方法近年来取得了可喜的成果。AFP增强子 可调控目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中高效特异表达。诱导凋亡也 是治疗肝癌的一种方法。已有实验证明抗CSF-1/CSF-1R的单抗可抑制 肝癌细胞的生长,证明CSF-1/CSF-1R是肝癌发生发展中的一对自泌/邻 泌系统,阻断其异常表达对肝癌治疗具有实际意义。目前关于肝癌中c- fms癌基因异常激活及高表达机制尚在探索中,迄今未见反义c-fms基 因对肝癌细胞生物学行为影响的报道。 目的 观察肝癌发生过程中c.rms癌基因是否存在缺失或突变,以及它们 与肝细胞癌变的关系及意义,为进一步阐明肝癌的发生机理提供依据。 同时检测肝癌发生过程中c.rms癌基因甲基化水平的变化,以阐明c. fiYI.----SF一 在肝癌组织中的异常高表达机制。通过构建人反义 C-ho真 核表达载体及携带AFP增强子的c.fms反义真核表达载体,观察两种载 体转导入肝癌细胞后对肝癌细胞生长的影响,为肝癌的基因治疗探索一 种新的方法。 % 1.肝癌中c-fluS癌基因突变及其临床意义 1l材料:提取经病理学证实的30例肝癌及其配对癌旁肝组织DNA, 男25例,女5例,年龄32—76岁,平均55岁。对照组织取自HBV 阴性的肾移植供体正常肝组织。 1.2引物设计:设计两对引物分别分析CSF.IR第301、969位密码子。 引物1:上游(F):5’.GAATTCGCCA GATOCTTGTG TGTTCTGC. 3,下游(R):5’.GTCGACGTCA CCTCCTGGAT GAGGT.3:两条 引物分别对应于C 4ifs4lls恤正链第14814—14835位和第1487卜14894 位核耷酸,可扩增产生 93hp的 DNA片段,C-fms第 301位酪氨酸 位于该片段内,上下游引物5’端分别引入EcoRI、Sail酶切位点。引 物二:上游(F):5’七AAe***T ATAATA***ATC T***O*O丁: 下游(K):5‘-GT*GA****G*TA******oTC 0***·3’:两条引 物分别对应于C-nS DNA正链第34103—34122位和第34264-34283 位核昔酸,可扩增产生193hp的DNA片段,C-fms第969位酪氢酸 位于该片段内,上下游引物5’端分别引入Ec。RI、Sail酶切位点。 1.3P*R反应:P*R反应体系so乃卜!,含灭菌水34石pl、loxbuffer 5刀 ul、dNTP(2.srnmow)4.0 nl、上下游引物(浓度 20pmU nl)各 2.5VI气模板DN A且刀VI与T的酶(*/VI,具有3’十5’外切酶活性)0.4 VI。扩增第301位密码子片段PCR反应参数:预变性94℃300秒; 30个循环,94℃变性60秒、55℃复性60秒、72C延伸60秒:72 .4· C延伸300秒。扩增第969位密码子片段PCR反应参数:预变性94 ℃300秒;30个循环,94℃变性60秒、55℃复性120秒、72℃延 伸120秒;72℃延伸300秒。反应结柬后取PCR产物5刀卜!行12% 聚丙烯酞胺凝胶电泳检测PCR产物的扩增效果及特异性。 1.4 SSCP分析:取 PCR扩增产物 10.0 ul加入碱变性液(0.smoljL NaOH、 ic。W**TA)5刀卜1,在沸水中煮5分钟,迅速放入冰浴中5分 钟,加入变性上样缓冲液(95%去离子甲酚胺、10mmol/L EDTA、口.25% 二甲苯青吓、O.25%涣酚蓝)3.0 yi。以正常肝组织为对照,正常对 照包括变性样本和非变性样本。18%聚丙烯酞胺凝胶(含 10%甘油) 10IllH恒流电泳,EB染色后拍照记录。 1.5 DNA测序:紫外透射下切割
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R735.7

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