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《第一军医大学》 2000年
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抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌细胞株表型和基因调控的影响

郑燕芳  
【摘要】: 目的 设计和克隆一种能特异性切割人乳头瘤病毒(HPV)16型E6 基因mRNA的核酶,研究该核酶对HPV16阳性的宫颈癌细胞株的恶性 表型、免疫学特性、凋亡表型和基因调控的影响,以探讨HPV的致癌 机制和治疗方法。 方法 1、采用计算机软件,针对HPV16E6基因设计锤头状核酶。 2、合成核酶的基因,克隆于原核表达质粒中,进行体外切割实验以鉴 定核酶的活性。3、将抗HPV16E6核酶装入真核表达质粒,以脂质体法 将核酶与空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别命名为CaSKi-R和 CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三 种细胞中E6基因的表达。4、测定三种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形 成率,并以皮下接种法检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力。流式细胞仪检 测三种细胞中HPV16E6、PCNA、C-erbB-2蛋白的表达。5、流式细胞 仪分析三种细胞的DNA和凋亡率,检测凋亡相关蛋白c-myc、bcl-2、p53、 Fas等的表达。6、流式细胞仪分析三种细胞的表面抗原HLA-1、HLA-2、 B7-1和B7-2的表达,诱导制备NK、LAK、CD3AK和肿瘤细胞激活的 LAK细胞,检测各种免疫细胞对CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi细胞的杀 伤效应。 结果 1、选择E6基因的170位为切割位点,设计锤头状的核酶, 两侧的结合臂各为9个碱基。2、体外切割实验证明抗HPV16E6核酶具 备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6 mRNA片段。3、 脂质体转染后,点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern 杂交证实CaSki-R中E6 mRNA的量比CaSKi-P、CaSKi明显降低。4、 CaSKi-P、CaSKi细胞生长速率相近,CaSKi-R细胞的生长速度明显降低。 与CaSKi细胞相比,CaSKi-R细胞表达HPV16E6、PCNA、C-ethB-2蛋 白明显减少,软琼脂克隆形成率显著降低,在裸鼠体内的致癌能力下降。 而CaSKi-P细胞无此改变。5、与CaSKi细胞相比,CaSki-R细胞的凋 亡率明显增高,出现凋亡峰,S期、GZM期细胞百分率下降。CaSKi-R 细胞表达HPV 6E6、C-myc、hcf上蛋白明显减少,而表达P53明显增 高:两者中FSS蛋白的表达相近。*ashF细胞中表达各种蛋白与*拈o 细胞无显著差异。6、CaSKi和CaSKIP细胞中HLA上、B7J、B7刁抗 原表达都很低,两者无显著差别。CaSKi-R中 HLA-2、B7-l、B7-2表 达均明显升高。三种细胞中HLA1表达率都很高。NK、LAK、CD3AK _细胞对 Caski-R细胞杀伤率显著高于 CaSXi细胞,CaSKi、CaSXi-R分 可 别激活的LAK细胞(称Ca-LAK和CaR-LAK)杀伤活性与LAK细胞 无明显差别,对CaSXi-R的杀伤活性高于CaSKi细胞。而各种兔疫细 胞对CaSXiP细胞的杀伤率与CaSXi细胞无显著差异。 结论 所获得的抗 HPV 6E6核酶能特异性切割 HPV 6E6 InRNA。 该核酶的导入不但能部分逆转 HPV阳性的宫颈癌细胞株 CaSKi的恶 性表型,而且使Caski细胞易于被机体免疫系统识别杀伤,难于免疫逃 避,并能诱导Caski细胞发生凋亡。其原因可能在于病毒癌基因E6表 达的降低,以及由此而引起的细胞内蛋白表达水平的改变,包括PCNA、 C-erbB-2、HLA-2、B7-l、B7-2、P53表达的上调,c-myc、bclZ表达 的下调。抗 HPV 6E6核酶不能提高 Caski细胞的免疫原性。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R737.33

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