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《第一军医大学》 2000年
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基因重组 人FasAD多肽的研制及其对移植物抗宿主反应的免疫抑制效应初探

冯晓勤  
【摘要】: 近年来对移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease,GVHD) 的基础研究日益趋向于分子免疫病理机制的探讨。动物实验研究发现, Fas/FasL途径中FasL的功能性表达在GVHD的发生、发展过程中发挥 了十分重要的作用。我们对20例造血干细胞移植病例进行的FasL监测 结果亦支持上述论点:异体移植组在移植后T细胞表达FasL较正常对 照组和自体移植组明显升高(P<0.05),其中发生Ⅱ度急性GVHD组的 FasL表达较0~Ⅰ度急性GVHD组显著升高(P<0.01),T淋巴细胞表 达FasL与急性GVHD呈正相关。因此提示,阻断Fas/FasL途径可成为 减轻GVHD的新策略。 由于Fas分子的死亡信号激发域(Fas Activition Domain,FasAD) 是FasL识别、激活Fas分子的重要功能域,含FasAD的多种变异体具 有与FasL的竞争性结合活性,能阻断FasL诱导的细胞调亡。因此我们 立题研制仅含Fas分子死亡信号激发域的低分子量生物活性多肽(命名 为FasAD多肽),将这种可溶性受体作为免疫阻断剂,用于GVHD的生物 免疫治疗研究。 我们根据Genebank提供的人Fas cDNA全长设计了2对半引物,采 用半巢式RT-PCR和基因重组技术克隆了编码人Fas死亡信号激发域的 cDNA片段,DNA序列测定证实了克隆片段碱基序列完全正确。然后将 靶基因片段分别重组进入两种融合方式的Intein表达型载体pTYB2和 pTYS12中,构建了N-端融合靶基因的FasAD_N-pTYB2重组载体和C-端 融合靶基因的FasAD_C-pTYB12重组表达载体。将重组载体转化大肠杆 菌ER2566菌株,经PCR和限制性内切酶分析证实两种重组表达载体构 建正确。 两种重组表达载体在IPTG的诱导下不仅成功地表达了约60KD的重 组蛋白,而且实现了重组蛋白的可溶性表达,其中,FasAD厂PTYB12 的表达量高于FPSAD厂PTYBZ。应用低压液相色谱法对重组蛋白进行一 步法亲合层析,分离纯化获得FasAD。和FasAD。多肽。应用Western-blot 鉴定重组蛋白和FasAD。、FasADc多肽具有良好的Fas抗原性。上述结 果说明,IMPACT系统用于低分子量多肽的制备切实可行,其中,C-端 融合的方式更利于产品的大量制备。 体外对FasAD。和FasADc多肽的生物活性进行鉴定。PI单标法和 Annexin-V/叮 双标法的流式细胞术检测结果显示,它们能显著降低 rhFasL诱导的Jurkat细胞凋亡率(Pwto.01),说明它们具有竟争性结 合 FasL的生物活性。用 FasL+淋巴细胞作用于hs敏感的 Jurkat细胞 导致Jurkat细胞凋亡的模型来模拟Fas/FasL介导的GVH反应,结 果显示,FasAD。和FasAD。多肽也能显著抑策Jurkat细胞的凋亡*< 0.05),提示FasAD。和FasAD。多肽在体外具有对Fas/FasL介导的GVH 反应的免疫抑制效应。在上述两种模型中,两种多肽的生物学作用之间 并未见显著差异。 本课题应用基因重组技术制备含Fas分子功能域的低分子量生物活 性多肽,旨在探索GVHD新的治疗靶点及可行性。该项研究为GVHD的 生物免疫治疗提供一个新的策略和方法奠定了理论和实验基础。
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