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《第一军医大学》 2000年
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幽门螺杆菌粘附素HpaA的克隆、表达及其免疫原性和保护性研究

陈烨  
【摘要】: 背景/目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染了世界上一 半以上的人口,是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病原因子,与胃 腺癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生亦密切相关。现有的 根除Hp的手段主要是联合应用抗生素,但由于该菌感染的普遍性、耐 药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等,限制了抗菌药 物的疗效,进行免疫防治研究十分迫切。鉴于Hp粘附于胃上皮细胞是 其定植并致病的前提,阻断Hp的粘附显然可以防治Hp感染。因此本 研究的目的是:选择暴露于细菌表面并与Hp定植密切相关的粘附素 HpaA为目标,通过基因工程技术获得重组粘附素蛋白rHpaA,分别在 体外和小鼠模型中评价其免疫原性及对Hp感染的免疫保护效果,以确 定rHpaA在Hp疫苗研制中的应用价值。 方法:(1)运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出hpaA结构基因, 装入pUC19载体并进行序列分析;(2)将hpaA基因亚克隆入表达载体 pTrc99A并在大肠杆菌JM109中表达,硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层 析两步纯化表达产物rHpaA,免疫印迹法检测其抗原性;(3)流式细胞 术及光镜计数法研究rHpaA及其抗体对Hp与胃上皮细胞粘附的影响; (4)ELISA法测定Hp感染者血清中抗HpaA抗体,~3H掺入法测定人外周 血淋巴细胞(PBL)对rHpaA的增殖反应,体外评价rHpaA对体液和细胞 免疫的影响;(5)流式细胞术检测rHpaA选择性增殖Th细胞表型的 作用,探讨rHpaA可能的免疫保护机制;(6)建立Hp感染小鼠模型, 在该模型中评价rHpaA、Hp超声破碎抗原(HpSON)与佐剂CT结合 预防Hp感染的效果,运用半定量尿素酶试验和组织切片Giemsa染色 法观察细菌定植量的改变;(7)组织切片HE染色检查免疫后小鼠胃粘 膜的病理学改变;(8)ELISA法检测免疫/攻击前后小鼠血清中抗HpaA 抗体产生情况。 结果:0)成功构建了砂aA的重组质粒pUC娜a,序列分析显示 hpaA结构基因由 783hp组成,开放读框完整无中断,编码 261个氨基 酸,其中一段氨基酸序列KRTIQK与大肠杆茵粘附素SfaS、K99、CFAjl 中的涎酸结合位点的结构相似;*仔ns二acs显示表达产物相对分 子量约29kD,可溶性表达占全茵蛋白的20%以上,两步纯化后获得纯 度达90%的重组蛋白枷aA,免疫印迹显示该蛋白可被幽门螺杆菌全菌 抗体识别;p)rHpaA和rHpaA抗血清均能部分阻断Hp与胃上皮细 胞系的粘附,在流式细胞术中表现为Kat。Ill细胞结合标记细菌的平均 荧光强度下降,但仍未降为零;在光镜下表现为经抗 HpaA兔血清预处 理后,每细胞周围粘附的细苗数较阴性对照免疫前兔血清预处理组明显 减少(35.5土 15* VS 128.3土40.5,P<0.of);(4)ELIS法共检狈了 80份患者血清,以 HpSON为平行对照,paA及 HpSON包被下的阳 性检出串分别为50%O0/80)及53.75%O 卜两法检出槽况无显著性 差异印>0.05h不论培养基中是否加入IL工,p aA均可刺激Hp”PBL 的增殖,加入IL2后Hp”PBL对paA的增殖幅度超过无n2时 (P<0.05):(5)*才**L细胞与培养液、尿素酶及m纵分别孵育后, IL-4阳性T细胞比例分别为9.26%、10.2%和25.63%,HPaA可选择性提 高IL-4”细胞即ThZ细胞比例(P<0.05);Hp“PBL细胞与上述各组分 别孵育后,HpaA同样将IL4单阳性细胞从对照的z44$提高到17.33% (P<o.05),且可明显发现一个小的细胞分布亚群的形成,尿素酶则无 此作用;仍)兔疫各组在受末次攻击后2周及8周,Hp定植量均有不 同程度下降,以rH p卯卜*T组下降最明显o<o.01),有佐剂组较同一 抗原的无佐剂组细茵定植量明显下降(P<0刀5),攻击后8周不论是阴 性对照还是免疫组,Hp定植密度均有上升趋势;尿素酶试验和组织学 检查的结果基本一致:(7)各组小鼠在Hp末次攻击后二周胃粘膜几乎 均未见淋巴细胞及中性粒细胞浸润;攻击后吕周阴性对照PBS组5只 小鼠均有轻到中度淋巴细胞浸润,各免疫组从CT组到HpSON组、rHpaA 组炎症程度依次较轻,枷囚A+*T组最轻,偶见淋巴细胞0功刀1\(8 抗原免疫后Hp攻击前,tHpat组、rHpat+CT组IgG抗体滴度即明显 升高0功刀05),而 CT组、HpSON组及 HpSON+CT组则无升高 O>0.05);不论是攻击前、攻击后二周或8周,p乙A组及rH*囚A十 .4. *T组的抗体水平均明显高于*的ON组及*咋ON十*T组(P<o.01)。 结论:*)首次获得与HP定植密切相关的粘附素HPaA的基因工程 蛋白产物,为伽疫苗研制提供了一种新抗原:(2)体外粘附实验证实 地aA参与了地与胃上皮细胞的粘附过程;p田paA是具有免疫原性 的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫:o)于 体外首次发现HpaA能选择性增殖ThZ细胞,提高了HpaA在疫苗应用 中的可行性:归)动物实验表明巾paA联合佐剂能显著降低即在小鼠 胃内的定植密度,同时胃粘膜炎症反应减轻
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7 香港麦迪信医学出版有限公司供稿;拯救幽门螺杆菌![N];医药经济报;2003年
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