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《第一军医大学》 2000年
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蛋白激酶C(PKC)在血管内皮细胞通诱性调节中的作用

杨滔  
【摘要】: 目 的: 蛋白激酶C(PKC)通道是一条重要的细胞内信号传导通道,许 多实验证明蛋白激酶C的激活在调节内皮屏障功能中起着重要的作用。 本实验室的前期工作表明,PKC通路是组胺介导血管通透性增高的信号 过程中的重要部分。PKC激动剂佛波酯醇可使游离微静脉对荧光白蛋白 的通透性明显增高,PKC的特异性抑制剂可以阻止组胺介导的微静脉通 透性的升高。静息情况下,PKC绝大多数位于细胞的胞浆部分,胞膜部 分含量很少,当细胞受到某些刺激(如抗原或某些炎性介质)之后,胞 膜中的磷脂被磷脂酶分解产生二酰基甘油(DAG),DAG的增加可激 活胞浆中的PKC,使其从胞浆转位至胞膜,这种转位是PKC活化的重 要标志。有研究表明PKC只有在活化状态才能产生其调节作用。本研 究目的之一,就是观察血管内皮细胞在PKC的激动剂佛波酯醇 (PMA)的作用下,PKC是否发生了转位活化,以在细胞水平验证微 静脉的实验结果。革兰氏阴性菌的主要毒性成分脂多糖(LPS)是导致 临床上的中毒性休克的主要介质,研究证明,LPS作用于内皮细胞,可 迅速引起细胞骨架蛋白的解聚和重组,细胞与细胞间和细胞与基底膜间 的粘附连接松解,细胞间缝隙形成,最后导致微血管通透性升高。但 LPS介导血管通透性升高的具体信号通路现仍不明了。本研究的第二个 目的,就是观察LPS作用于内皮细胞后对PKC活性和转位的影响,探 讨LPS激活内皮细胞的途径。严重烧伤后全身微血管通透性增加是造成 低血容量性休克和器官功能损害的重要原因,但其发生机理未完全阐 明。本实验的另一个目的,是观察烧伤血清作用与内皮细胞后对PKC 转位活化的影响。通过研究PKC在上述典型的血管通透性升高过程的 变化和作用,探讨血管通透性调节的机理。 方 法: 用最适佛波酯醇(PMA)浓度(100nmol/L)在不同时段刺激培 养的人脐静脉内皮细胞株 ECV-3 04和大鼠肺内皮细胞。收集、超声裂 解细胞,细胞悬液离心,所得上清液为细胞浆蛋白粗提液,沉淀经混匀 溶解再离心,上清液即为细胞膜蛋白粗提液。在反应中选用同位素卜 ‘ZP-ATP酶标记 PKC的特异底物髓磷脂碱性蛋白(MBP。;*,利用液体 闪烁记数仪测定髓磷脂碱性蛋白(MBP。-;/中被PKC催化磷酸化时被 置代的Y-’ZP-磷酸根基团放射活性进行PKC的活性测定。并分别用脂多 糖(LPS)、烧伤血清刺激细胞,用同样方法检测PKC的活性。用 PKC了制剂「PKC(1-36)」提前处理细胞,再用PKC的激动剂PMA。 脂多糖(LPS)、烧伤血清刺激细胞,然后测定胞膜及胞浆PKC的含 量。通过测定刺激前后胞膜、胞浆PKC含量的变化,分析PKC激动剂 和烧伤血清对PKC转移和活化的影响。 结 果 实验证明,未受刺激的细胞,胞浆中的中PKC活性是43.47 fmol’‘P/mg/min。明显高于胞膜的 23.12 fmol”P/mg加in(P<0.05),提 示此时P*C主要位于胞浆。用佛波酯醇(P*A)刺激可引起胞膜中 PKC活性迅速增高,相应胞浆中的PKC活性则下降。PKA刺激内皮细 胞 smin。10min后,胞膜中 PKC活性分别升高至 31.99 fmol32P/mg/min 和 34 fmol’ZP/mg/min。而胞浆中的 PKC 则分别下降为 33.50 fmol32P/mg/min和 32.sl fmol’ZP/mg/min。PMA刺激 30min后,胞膜中的 PKC活性达到高峰为 48.43 fmol32P/mg/min(与未受刺激时胞膜中 PKC 的活性水平相比P<0刀引,相对胞浆中P*C的含量也跌至最低的32石0 且n01’午/m旮mh(与未受刺激时胞浆中P*C的活性水平相比P<0刀5)。 用PKC的特异性抑制剂[PKC厂上6厂提前处理细胞后再用PMA刺 激,则胞膜和胞浆的PKC活性与静息状态相比没有显著差异,表明 PKC没有发生转位活化。分别用LPS和烧伤血清作用于内皮细胞,胞 膜和胞浆中PKC活性变化的趋势与PMA刺激细胞引起PKC的转化结 果基本相同。 结 论 -5- l.用PKC的激动剂PMA刺激内皮细胞,产生时间依赖性胞膜PKC活 性增加,伴相应胞浆PKC活性下降。用PKC的特异性抑制剂预处理细 胞后则抑制了这种变化。说明PKC被激活后发生了转位。 2.用中毒性休克的主要介质脂多糖LPS刺激内皮细胞也同样出现时间 依赖性胞膜PKC活性增加,伴相应胞浆PKC活性下降。提前用PKC的 抑制剂处理细胞也可抑制PKC的转位。提示内毒素性休克时LPS可以 通过激活内皮细胞PKC,使其发生转位,从而影响内皮细胞的功能, 导致内皮细胞屏障功能的变化。 二.烧伤血清作用于内皮细胞,也可以激活PKC并使其发生由胞浆至 胞膜的转位。提示烧伤时血管通透性的升高与PKC的活转位由密切关 系。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R362

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