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《第一军医大学》 2000年
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mRNA差异显示筛选大肠癌相关基因

南清振  
【摘要】: 目的:肿瘤的发生发展就细胞而言,是由于原癌基因的激活和抑癌基因 的失活而造成的,所以癌基因与抑癌基因的研究对探索肿瘤发病机理,寻找 预防和治疗肿瘤的措施具有重要意义。大肠癌在消化道肿瘤的发病率较高, 且容易复发和转移。目前人们对大肠癌的分子发生机制认识仍然不十分清 楚,许多研究表明大肠癌的发生涉及一系列基因的变化,包括显性癌基因、 错配修复基因及众多的肿瘤抑制基因。本研究的目的就是要利用近年发展起 来的基因筛选方法,通过比较正常大肠粘膜与大肠癌之间基因表达的差异, 分离并克隆出大肠癌发病的相关基因,从基因的分子水平探讨大肠癌的癌变 机理,以期为大肠癌的早期诊断及基因治疗提供理论依据。 方法:正常大肠粘膜与大肠癌组织作为研究对象,提取组织总RNA,利 用mRNA差异显示(differential display PCR, DDRT-PCR)的技术,以随机 引物AP1~6与锚定引物HT11C/A/G配合,PCR扩增cDNA后,6%的非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳,-70℃于X线胶片上放射性自显影,筛选大肠癌特异性 表达的cDNA片段。并对该差异筛选出来的cDNA片段进行二次PCR、亚克 隆、测序、序列分析和斑点杂交等实验研究。 结果:经差异扩增与显影后,可见十余条差异条带,选择其中的五条差 异条带进行第二次PCR扩增,并分别与pUC18载体及TA载体进行连接,经 蓝白斑筛选及限制性内切酶酶切分析,证实为阳性重组子。提取质粒后进行 测序,通过Gene Bank数据库进行了序列的同源性比较,发现其中的两条 cDNA片段序列分别与Gene Bank数据库中的Raf-1和酪氨酸蛋白激酶序列有 60%和80%左右的同源性;另有两条序列与Gene Bank数据库中的序列比 较,没有同源序列;另一条序列为转运核糖体的重复小序列。我们把其中与 Raf-1有同源序列的一条差异条带制备成地高辛标记的探针,与大肠癌细 胞、大肠癌及癌旁正常大肠粘膜组织所提取的RNA样品进行斑点杂交,发现 此片段在大肠癌细胞及大肠癌组织所提取的RNA中表达丰度较高,而在正常 肠村腑织织所提取的刚八中的表达丰度较低。故推测该差异显示片段可能足 人肠癌川关基因,扰们把它命名为CGI。下一步我们的主要工作是进行 Northern杂交分析,预测其全长的mRNA的长度;组织切片的原位杂交,分 析其在大肠癌组织中的表达情况;通过RACE扩增的方法,获得全长的 山N八;通过氨基酸序列推导预测它的功能,并进行一系列的功能分析。同时 把其它的差异片段也进行同样的研究。 结论:通过mRNA差异显示技术能够快速的发现大肠癌差异显示基因, 目前差异筛选出来的十余条大肠癌差异显示基因片段中,己有一条经过 mRNA斑点杂交的初步鉴定,发现该基因片段很可能是与大肠癌相关的新的 致癌基因。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R735.34

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