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竞争性RT-PCR和毛细管电泳定量检测慢性髓细胞性白血病BCR-ABL融合基因mRNA

田红  
【摘要】: BCR-ABL融合基因是慢性髓细胞性白血病的分子标志。目前大多数 实验室是对该基因的mRNA进行定性检测或半定量检测。我们根据竞争 性RT-PCR的原理设计和构建了该基因的RNA参照物,并利用毛细管电 泳技术对竞争性RT-PCR的产物进行分离分析,建立了对该基因精确的 定量分析方法。 首先根据既有引物在BCR-ABL mRNA序列中的位置,并结合该序 列的酶切分析结果,设计合成一条与原下游引物相似的新引物,经错配 PCR的方法,扩增出与原模板相差仅四个碱基、两端引物结合序列完全 相同的内参照物cDNA。该cDNA经限制性内切酶酶切分析和毛细管电 泳分析证明其可行性,然后平端克隆至pGEM-T载体,制备出JB196和 JB121两型质粒并转化JM109大肠杆菌长期保存。利用RiboMAX~(TM)体 外转录系统合成内参照物RNA,得到两种扩增效率与CML融合基因几 乎完全相同的竞争性RNA参照物。 将含两种BCR-ABL融合基因样本的细胞总RNA,分别与不同浓度 梯度的内参照物RNA在同一体系中进行RT-PCR扩增,扩增产物通过聚 丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳进行鉴定和分析。比较竞争性序列和靶 序列在毛细管电泳上的出峰时间和峰面积,并对两者积分面积之比的对 数作图,SPSS统计软件分析其线性相关关系。由于两者在反应过程中保 持相同的扩增效率,其终产物的比例即反映了初始模板的比例,据此可 根据已知内参照物的含量推知待测模板的含量。 我们采用构建的BCR-ABL两型融合基因的竞争性内参照物RNA, 分别对K562细胞和b2a2型CML细胞总RNA中BCR-ABL融合基因转 录本的数量进行了初步检测,并对该方法的可靠性和重复性进行了检验。 结果表明,所构建的内参照物符合设计要求,对毛细管电泳的重复性检 验表明结果重复性好,定量分析方法准确可靠,实用性强,值得临床推 广。


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