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《第一军医大学》 2000年
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腺相关病毒载体介导外源基因入人外周血干/祖细胞的实验研究

胡舜英  
【摘要】: 研究背景与目的:自八十年代后期以来,基因治疗用于肿瘤、 血友病、艾滋病等疑难疾病,取得了令人鼓舞的进展。具有自我复制、 自我更新及分化能力的造血干细胞是基因治疗重要的靶细胞之一。但是 在以造血干细胞为靶细胞的基因治疗中,存在的主要障碍是如何将外源 基因导入处于静止状态的造血干细胞中。而在为人类疾病基因治疗提供 一种安全、有效的载体的研究中,腺相关病毒载体日益受到重视。在 一些肿瘤的化疗过程中,化疗药物对造血系统的抑制作用严重影响了疾 病的治疗效果,人类造血干细胞中的mdr1基因表达水平不足以对抗化 疗药物引起的造血功能抑制。有实验表明多药耐药基因(mdr1)转移 入造血于/祖细胞可保护和支持机体的造血功能。因此我们设想以AAV 为载体,将mdr1基因导入外周血来源的造血干/祖细胞,从根本上解决 造血功能抑制。 绿色荧光蛋白(GFP)基因来源于Aequrea Victoria水母,目前,GFP CDNA主要被广泛用作基因转导时的报告基因。 方法:本文采用腺相关病毒载体介导的基因转移方法,将人多药 耐药基因(mdr1)导入人造血干/祖细胞,并对转基因造血细胞的耐药 性进行了初步研究。以AAV的一种多克隆载体为基础,构建了携带mdr1 基因的重组腺相关病毒载体(rAAV/mdr1),经293细胞包装成重组病 毒;将重组质粒、重组病毒分别转染及感染NIH3T3细胞,经PCR检 测,NIH3T3细胞中含有mdr1cDNA;转基因细胞用秋水仙素加压培养, MTT法显示了mdr1在NIH3T3细胞中的表达,并产生了一定的活性。 采用集落刺激因子动员后的外周血,用MiniMACS免疫磁珠纯化 外周血中的CD34阳性细胞,纯度最高可达98%。将rAAV/mdr1感染 CD34阳性细胞,PCR证实经AAV载体介导,可将一定量的mdr cDNA 导入CD34阳性细胞;秋水仙素加压培养,MTT法显示转基因组与未 转基因组耐药性有一定差异。将rAAV/GFP(病毒所赠)感染CD34 阳性细胞,荧光显微镜下观察,约20-30%细胞中可见绿色荧光。 结果:1.成功构建了rAAV/MDRI重组载体,井成功表达;2. MiniMaes兔疫磁性分离法可有效纯化外周血CD34阳性细胞,纯度最 高可达98%;3.在本实验设定的培养体系中,CD34阳性细胞的比例 在 144h时仍保持在较高水平;4.rAAV/GFP重组病毒感染外周血造 血干祖细胞,感染率可达20-30%,并在外周血干祖细胞中表达绿色荧 光蛋白;5.PCR证实腺相关病毒载体可将 mdrl CDNA导入外周血造 血干祖细胞,MT’I’法证实转基因细胞耐药性较未转基因细胞有所提 高。 结论:腺相关病毒载体可将外源基因成功导人外周血干/祖细胞。 但需进一步改善AAV包装系统和基因转染技术,以提高基因转导效 率。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:R550.2;R329.2

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【参考文献】
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