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《第一军医大学》 2001年
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重组人肝细胞生长因子的真核表达及对小鼠实验性肝纤维化的治疗作用

丘玉昌  
【摘要】: 目的 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是由间质细胞 产生的一种细胞因子,具有促使细胞分裂、移动和组织器官的形态发生, 以及诱导和启动肝再生的作用,在肝脏、肺脏和肾脏等脏器的损伤后再 修复中发挥重要作用。本实验采用真核表达质粒,在哺乳动物细胞株 CHO-K1中表达了重组人肝细胞生长因子(recombinant human hepatocyte growth factor,rhHGF),并对其进行初步纯化。由于rhHGF的表达水平 较低,难以获得足量的rhHGF进行体内实验,因此,将表达质粒导入小 鼠体内,观察rhHGF对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)诱导的小 鼠肝纤维化的拮抗作用,并对其作用机制进行研究。 方法与结果 根据实验目的,本文的实验可分三部分: 1、rhHGF在CHO-K1细胞中的表达 聚乙烯二醇沉淀法纯化真核稳定 表达质粒pEE14/rhHGF,用Lipofectin试剂介导质粒DNA转染入 CHO-K1细胞中,蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoxmine,MSX)筛 选阳性细胞克隆。通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法,从阳性克隆细胞中扩增出人 HGFmRNA特异性396bp片段,证实rhHGF在mRNA水平上得到表达; 通过酶联免疫吸附实验(enzyme linked immuno sorbance assay,ELISA) 确定培养上清液中rhHGF的含量在8-10μg/L左右,证实rhHGF在蛋白 水平上得到表达。细胞培养上清液明显促使[~3H]同位素标记的胸腺嘧啶 脱氧核苷掺入原代培养的大鼠肝细胞,显示上清液促进肝细胞DNA的合 成,表明获得的CHO-K1阳性克隆细胞株能表达有活性的rhHGF。 2、rhHGF的纯化 首先应用超滤的方法除去培养上清液中分子量小于 10KD的组份,随后采用Heparin-Sepharose CL6B亲和层析柱进一步分离。 洗脱的组份经ELISA法检测,发现rhHGF主要分布在0.9至1.3M NaCl 之间的洗脱部分。SDS-聚丙烯酚胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,非还 原条件下,约60KD处有较均一条带;还原条件下约62和34KD处各有 一条带。[‘H同位素掺入实验表明,纯化的 hHGF明显促进大鼠肝细胞 DNA的合成。 3、rhHGF对小鼠肝纤维化的桔抗作用 由于获得的CHO.KI细胞株每 升培养液中的表达量只有微克水平,难以大量提取纯化进行动物体内实 验,因此本实验采用将hHGF表达质粒导入小鼠体内的方法,观察其对 小鼠肝纤维化的保护作用。首先制作CC14诱导的小鼠肝纤维化模型,然 后将 50 ug pUC七R a /hHGF真核瞬时表达质粒包裹在仙台病毒融合蛋 白-核蛋白组分HMGI脂质体混合物中,造模后第三周开始每5天一次 由尾静脉注射人小鼠体内,同时设腹腔注射复方丹参为治疗对照组。在 注射质粒后第1、3、5天,分别于小鼠肝脏和脾脏中可检测到rhHGF InRNA的RT-PCR扩增片段;通过ELISA法分别在注射质粒后第1、3、 5、7天检测到小鼠血浆中 hHGF的含量为 40.53pg/thl、49.84pg/ffil、 45.39Pg/ml、52.31Pg/ml,从而证实 hHGF在小鼠体内得到表达。8周后, 取血清做生化检测,剖取小鼠肝脏制作石蜡切片,分别进行HE染色、 Masson氏结缔组织染色、网状纤维的银染,结果表明,pUCSR a /rhHGF 治疗组明显降低血清谷丙转胺酶(GPT),提高血清白蛋白水平。病理切 片显示,模型组肝组织呈典型的肝纤维化病变,复方丹参治疗组病变较 轻,PUC石R a lrilt1GF治疗组能促进肝实质细胞增殖,明显抑制胶原纤 维的沉积,病变最轻。蛋白免疫印迹法(western blot)显示,pUC习R a aHGF治疗组的肝脏中细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear aninen,PCNA)的表达水平高于造模组及复方丹参组,转化生长因子 6 山fdrisfognifig growth factof pl,TGF fil)和口平滑肌肌动蛋白(Q SmOOth muscle actin,a七MA)的表达水平低于造模组及复方丹参组,表明尾 静脉注射 pUC石R a /rhHGF质粒可促进CCI’诱导的肝纤维化小鼠肝细胞 DNA合成,抑制TGF pl和Q-SMA的表达。 结论 1、获得能表达有活性 rift1GF的 CHO{ 细胞株,表达量在 8 t以上。 2、通过肝素亲和层析,获得初步纯化的具有生物学活性的rilriGF。 3、尾静脉注射 PUCSR a /rhHGF表达质粒对 CCI。诱导的肝纤维化具有 叫一 明显的桔抗作用,其机制可能在于促进肝细胞增殖以及抑制TGF pl的产 生。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R965

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