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《第一军医大学》 2001年
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中国人β地中海贫血突变基因库的构建

莫秋华  
【摘要】: 目的 构建一个完整的中国人β-地中海贫血(简称β-地贫)突变基因标准 样品库。这个已知基因背景(DNA顺序)的样品库可作为一种标准品用于 评价包括基因芯片在内的检测中国人β-地贫的诊断新技术的特异性和可 靠性。 方法 1、中国人β-地贫13种常见突变类型克隆基因库的构建:根据本实验室 已保存的中国人β-地贫标本,首先采用PCR技术直接从人基因组DNA 样品中获取目的基因—含某一突变的β-珠蛋白基因,然后运用经典的基 因工程技术将其克隆至pGEM-T载体,转化的宿主菌为大肠杆菌 JM109。每个克隆重组子中插入的目的基因进行DNA测序以验证基因 突变型。 2、16种中国人β-地贫稀少突变类型克隆基因库的构建:通过基于PCR 设计的人工致突变反应体系从野生型样品中制备含所需点突变的目的基 因,再运用经典的基因工程技术将诱变得到的目的基因进行克隆并测序 鉴定。 3、两种改进的大引物PCR定点诱变方法的建立 方法1:构建一个含全长野生型β-珠蛋白基因的质粒DNA模板,第 1轮PCR由中间的突变引物和正向外侧引物合成大引物,在第2轮PCR 凝胶纯化后的PCR产物—大引物全部加入反应管同反向外侧引物一起 合成全长诱变终产物。 方法2:在两轮PCR中设计两种不同的质粒DNA模板,两者分别 缺少正向或反向外侧引物可结合的互补序列,这样两种质粒DNA模板 不可能同时被两条外侧引物扩增而产生全长野生型目的基因序列。第1 轮PCR由正向外侧引物和突变引物在质粒1的指导下合成大引物,这 一产物无需凝胶纯化而直接取小量(2~3μl)用于第2轮PCR反应。第2 轮PCR的第1阶段在质粒2的指导下由大引物延伸合成全长突变终产 物,两条外侧引物则在第2阶段指数扩增,所有终产物均含所需致突变 位点。 结果 成功地定点诱变了中国人卜地贫16种稀少突变类型,诱变的成 功率可达 100%。完整地构建了含 29种中国人p-地贫突变基因的克隆 库。 结论 本研究建立了两种改进的、简便易行的大引物PCR定点诱变方 法,此方法可用作研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系 的基本技术。本研究的完成也为本实验室保存珍贵的DNA样品提供了 一套常规的技术方法。研究所得到的中国人卜地贫突变基因克隆库在诊 断用中国人卜地中海贫血基因芯片的研制中为建立反应体系发挥了重要 作用,并可作为将来基因芯片新药报批的标准品。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R556.61;Q78

【参考文献】
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